Разработка мер предупреждения микробной контаминации эмбрионов на технологических этапах их подготовки. При изучении бактериальной загрязненности половых путей реципиентов в разные фазы полового цикла нами установлено, что в лютеальную фазу микробная контаминация выше, чем в эстральную, т.е. в это время матка наиболее чувствительна к микробному фактору.
Кроме этого, нами доказано отрицательное влияние микробного фактора на приживляемость.
Поэтому возникла необходимость в разработке мер предотвращению микробной контаминации на всех этапах трансплантации. С целью предупреждения заноса инфекции в матку реципиента контаминированными эмбрионами на всех этапах трансплантации осуществляли бактериологический контроль. Бактериологические исследования показали, что промывные буферные среды содержат большое количество микроорганизмов, которые могут абсорбироваться на зоне пеллюцида эмбриона, а в дальнейшем при пересадке его переносится в матку реципиента.
Поэтому мы считаем, что важным моментом в комплексе профилактических мероприятий микробной контаминации при трансплантации эмбрионов является санация промывных буферных сред и отмывка эмбрионов. Для санации промывных буферных сред и отмывки эмбрионов мы испытали различные комплексы антибиотиков. Контролем служили пробы. отобранные из промывных буферных сред и сред из чашек после отмывки эмбрионов без антибиотиков. Для исследований использовали чистые культуры микроорганизмов, ранее выделенные из половых путей коров и телок, а также промывных сред матки доноров.
Результаты исследований представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что в сравнительных опытах по санации промывных буферных сред с инокулированными чистыми культурами в разведении 1 10 микробных тел мл использовали комплексы антибиотиков пенициллин 100 Ед мл гентамицин 4,6,10 и 12 мкг мл ампициллин гентамицин в тех же концентрациях пенициллин 100 Ед мл стрептомицин 50 Ед мл. Результаты бактериологических исследований после инокуляции культур и добавления антибиотиков через 1,5-2 часа показали, что к комбинациям пенициллин гентамицин в концентрациях 100 Ед мл и 12 мкг мл и ампициллин гентамицин в тех же концентрациях чувствительными оказались все взятые в опыт штаммы микроорганизмов.
Концентрация гентамицина 4, б, 10 мкг мл в комплексе с пенициллином 100 Ед мл значительно снижали рост микрофлоры, но полной бактерицидной активности не наблюдалось.
Комбинация пенициллина со стрептомицином, в указанных концентрациях, оказалась неэффективной против синегнойной палочки и испытуемого штамма кишечной палочки. Для санации промывных буферных сред использовали комплекс антибиотиков гентамицин ампициллин в концентрации 12 мкг мл и 100 Ед мл, предложенный А.Д.Бугровым и И.М.Величко 1986 . Нашими исследованиями подтверждено, что лучшим антимикробным средством является вышеуказанная комбинация антибиотиков. Таблица 1. Сравнительная активность комбинаций антибиотиков на чистые культуры микроорганизмов Концентрация антибиотиков мкг мл и ЕД мл Культуры микроорганизмов Количество проб Рост микроорганизмов на питательных средах МПА в чашках кол-во колоний МПБ Среда Булира Гентамицин 4 Пенициллин 100 В. Subtilis Ps. aeruginosa St. aureus E. coli 4 4 4 4 132-327 132-327 Гентамицин 4 Ампициллин 100 B. subtilis Ps. aeruginosa St. aureus E. coli 4 4 4 4 9-72 Гентамицин 6 Ампициллин 100 B. subtilis Ps. Aeruginosa St. aureus E. coli 5 5 5 5 ед Гентамицин 10 Ампициллин 100 B. subtilis Ps. aeruginosa St. aureus E. coli 2 2 2 2 - ед Гентамицин 12 Пенициллин 100 B. subtilis Ps. aeruginosa St. aureus E. coli 4 6 4 5 Гентамицин 12 Ампициллин 100 B. subtilis Ps. aeruginosa St. aureus E. coli 4 4 4 4 Пенициллин 100 Стрептомицин 30 B. subtilis Ps. Aeruginosa St. aureus E. coli 5 5 5 5 сп л. рост сп л. рост Примечание наличие роста отсутствие роста.
В контроле без антибиотиков во всех пробах наблюдали рост вышеуказанных культур микроорганизмов.
В последствии нами проведен опыт. Результаты приведены в таблице 2. Из данных таблицы 2 видно, что из 14 смывов, санированных комплексом антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл, соответственно, 12 - свободных от микроорганизмов, что составляет 85 . В контрольных смывах без добавления антибиотиков только 42,9 смывов стерильны.
Различия в росте микроорганизмов на питательных средах из контрольных и опытных смывов достоверны Р 0,001 . Учитывая вышеизложенное, мы считаем целесообразным для санации промывных буферных сред использовать комплекс антибиотиков гентамицин-ампициллин в концентрации 12 мкг мл и 100 Ед мл. Таблица 2. Действие комплекса антибиотиков гентамицин-ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл на микрофлору промывных сред Среды для вымывания эмбрионов Всего исследовано смывов Отсутствие роста микроорганизмов на питательных средах МПБ, МПА Количество Гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл опыт 14 12 85 Без антибиотиков контроль 14 6 42,9 Следовательно, из санированных промывных сред матки доноров большая вероятность получить деконтаминированные эмбрионы и предотвратить занос микроорганизмов в матку реципиента.
Полученые нами, промывные маточные среды от коров-доноров оценивали по внешним признакам цвету, прозрачности.
Из 14 проб, в которые антибиотики не добавляли, в 8 случаях 57,1 отмечали рост микрофлоры на питательных средах и по внешнему виду они были мутными с примесями слизи. Это было основанием предположить, что в промывную маточную среду слизь могла попасть из влагалища или шейки матки, а также из матки при наличии скрытого эндометрита.
Добавление антибиотиков в промывные буферные Среды снижали их бактериальную загрязненность и профилактировали эндометриты. Кроме этого, санированная промывная среда профилактирует возникновение эндометритов при многократном использовании доноров. Микроорганизмы, попадая в микротравмы при извлечении эмбрионов, могут вызвать эндометриты.
Об этом свидетельствуют данные В.И.Завирюхи, С.П.Хомина и соавт. 1987 . Проведенный ими анализ практической работы показывает, что после проведения нескольких вымываний у коров-доноров развивается гнойной эндометрит. Наши исследования по санации промывных буферных сред комплексом антибиотиков ампицилин гентамицин доказывают, что даже при многократном использовании коров-доноров на питательных средах МПБ и МПА из проб промывных буферных сред, наблюдается незначительный рост микрофлоры. У отдельных коров-доноров эмбрионы извлекали по 3-4 раза, тем не менее, ни у одного из них эндометрита не наблюдали.
Это свидетельствует о том, что санация промывных буферных сред является средством профилактики заболеваний матки у коров-доноров. В последние годы многие исследователи стали предлагать отмывку эмбрионов в нескольких стерильных средах, что по их мнению снижает концентрацию вирусов и бактерий в среде до неопасного субинфекционного уровня уже после третьего разбавления E. Singh et al 1982 D. Stringfellow et al 1984 . Для дополнительной гарантии полного блокирования случайной инфекции стали добавлять в стерильные среды антибиотики, либо обрабатывать эмбрионы ферментами трипсином E. Singh et al 1982 . Наши микробиологические исследования показали, что даже многократная отмывка эмбрионов стерильной фосфатно-буферной средой не всегда дает положительный антимикробный эффект.
Так, при многократном отмывании эмбрионов стерильными средами до пятой чашки из 25 исследованных нами проб, в 3-х наблюдали рост микрофлоры на питательных средах.
Для обеспечения стерильности эмбрионов нами было испытано многократное отмывание их в стерильных буферных средах с добавлением антибиотика гентамицина 12 мкг мл в комплексе с ампициллином 100 Ед мл. Установлено эффективное антимикробное действие этого комплекса антибиотиков табл. 3 . Хотя различия между контролем и опытом не достоверны, существует тенденция к снижению роста микроорганизмов в средах для отмывки эмбрионов, что позволяло получить стерильный пересадочный материал.
С целью определения времени действия антибиотиков на микрофлору использовали в эксперименте модель, которая состояла из среды Дюльбекко, антибактериальных средств и чистых культур микроорганизмов. В качестве антибактериальных средств использовали комбинации антибиотиков в ранее испытанных концентрациях гентамицин 12 мкг мл с ампициллином 100 Ед мл пенициллин 100 Ед мл со стрептомицином 50 Ед мл. Действие антибиотиков испытывали на ассоциации чистых культур микроорганизмов, ранее выделенных из половых путей доноров и реципиентов влютеальную фазу полового цикла Е. coli, Ps. aeruginosa, Вас.subtilis, Staph. aureus. После моделирования через каждые 15 минут производили высевы на питательные среды.
Таблица 3. Сравнительная оценка многократного отмывания эмбрионов средами с добавлением антибиотиков и без них Среды для отмывки эмбрионов Всего исследовано сред Рост микрофлоры на питательных средах МПБ, МПА Количество Гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл опыт 25 0 0 Без антибиотиков контроль 25 3 12 6,49 Опытная модель подвергалась воздействию комплекса антибиотиков гентамицин ампициллин, контролем служили пробы с антибиотиками пенициллин стрептомицин и без добавления антибиотиков.
Микробиологические исследования показали, что 15 минутное воздействие комплекса антибиотиков гентамицин ампициллин убивает ассоциации вышеуказанных микроорганизмов табл. 4 . Таблица 4. Влияние антибиотиков на микрофлору в промывных буферных средах Антибиотики, добавленные в среду Дюльбекко Экспозици мин. Рост микрофлоры на питательных средах МПБ МПА МПА в чашках кол-во колоний Гентамицин ампициллин Пенициллин стрептомицин Без антибиотиков 15 0 5 20 Гентамицин ампициллин Пенициллин стрептомицин Без антибиотиков 30 0 0 47 Гентамицин ампициллин Пенициллин стрептомицин Без антибиотиков 60 0 0 59 Гентамицин ампициллин Пенициллин стрептомицин Без антибиотиков 90 0 0 100 Примечание Вышеуказанные антибиотики в концентрациях гентамицин 12 мкг мл ампициллин 100 Ед мл, пенициллин 100 Ед мл стрептомицин 50 Ед мл рост микроорганизмов отсутствие роста микроорганизмов Таблица 5. Влияние антибиотиков на развитие эмбрионов п п Среда для культивирования эмбрионов Стадия развития Всего эмбрионов, шт. Стадия развития эмбрионов через 24 часа Количество развившихся эмбрионов МП БР БП БР БП БЭ Шт. 1 Без антибиотиков контроль 7 5 7 19 5 71,4 5 100 5 71,4 15 78,95 2 С комплексом антибиотиков Гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 10 ЕД мл 9 5 7 21 5 55,5 5 100 5 71,4 15 71,43 3 С комплексом антибиотиков Пенициллин стрептомицин 100 и 50 ЕД мл 6 5 4 15 3 50 2 40 3 75 8 53,33 Существенным качественным параметром развития эмбриона в культуре является образование бластоцеля.
В опыте, где была использована среда с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин ампициллин в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл, в контроле - среда с антибиотиками пенициллин стептомицин 100 и 50 Ед мл, во втором контроле - среда без добавления антибиотиков 5 из 7 71,4 , 5 из 9 55,5 и 3 из 6 50 эмбрионов развились из стадии морулы поздней МП в бластоцисту раннюю БР 5 из 5 100 , 5 из 5 100 , 2 из 5 40 эмбрионов развились из стадии бластоцисты ранней БР в бластоцисту позднюю БП 5 из 7 71,4 , 5 из 7 71,4 и 3 из 4 75 эмбрионов развились из стадии бластоцисты поздней БП в стадию бластоцисты экспандированной БЭ , соответственно табл. 5 . Полученные данные свидетельствуют о том, что контакт эмбрионов в течение 2-х часов в среде с комплексом антибиотиков гентамицин ампициллин в концентрациях 12 мг мл и 100 Ед мл, соответственно, не оказывает на их дальнейшее развитие более существенного влияния, чем комплекс антибиотиков пенициллин стрептомицин в общепринятых концентрациях 100 и 50 Ед мл. Учитывая большую бактерицидную активность предложенного комплекса антибиотиков по сравнению с комплексом пенициллин стрептомицин можно считать целесообразным его использование для санации промывных буферных сред и эмбрионов в практике эмбриотрансплантации.
С целью определения влияния комплекса антибиотиков гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл на приживляемость эмбрионов проведены опыты по пересадке их реципиентам.
При подготовке эмбрионов к пересадке мы проводили последовательное отмывание их в пяти чашках буферными средами, содержащими вышеуказанный комплекс антибиотиков.
Контролем служили эмбрионы, отмытые средами, не содержащими антибиотиков.
Отмытые опытные и контрольные эмбрионы пересаживали телкам-реципиентам.
Стельность определяли по результатам ректальных исследований.
Данные по влиянию антибиотиков на приживляемость эмбрионов приведены в таблице 6. Таблица 6. Влияние антибиотиков на приживляемость эмбрионов Среды для отмывки эмбрионов Всего исследовано реципиентов Из них стельные Количество Гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл опыт 28 21 75 Без антибиотиков контроль 32 16 50 Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что из 28 реципиентов, которым были пересажены эмбрионы, отмытые в средах с комплексом антибиотиков гентамицин ампициллин 12 мкг мл и 100 Ед мл, стельными стали 21 голова, что составило 75 , в контроле из 32 реципиентов только 16 голов оказались стельными или 50 . Таким образом, комплекс антибиотиков гентамицин ампициллин не только дает хороший антимикробный эффект, но и повышает приживляемость эмбрионов за счет того, что в матку реципиента вместе с пересадочным материалом эмбрионами вводилось небольшое количество среды с антибиотиками, которые создавали асептические условия в конкретном участке матки.
Поэтому мы рекомендуем всем пунктам трансплантации добавлять указанный комплекс антибиотиков в среды для отмывки эмбрионов. 4.5.2 Экономическая эффективность ветеринарных мероприятийЭкономический ущерб от снижения молочной продуктивности У2к 7 13,1 60 0,73 1049,38 грн. У2оп. 16 13,1 60 0,73 9180,48 Экономический ущерб от недополучения приплода У5 Кр Рв - Рф Сп, где Кр - коэффициент рождаемости Рв - планировалось отелится Рф - фактический отел Сп - стоимость теленка при рождении У5к 0,5 28-21 263,53 922,3 грн. У5оп 0,5 32-16 263,53 2108,24 грн. Уфк У2 - У5 12971,74 грн. Уф оп 9180,48 2108,24 11288,72 грн. Предотвращенный экономический ущерб при трансплантации эмбрионов Пу М0 Кз Кп Ц - Уф М0 - количество восприимчивого поголовья К3 - коэффициент заболеваемости Кп - удельная величина потерь основной продукции в расчете на 1 заболевшее животное Пу к 160 0,375 617,7 0,73-12971,74 14083,52 Пу оп 160 0,375 705,55 0,73-11288,72 19614,37 Зв к 152,3 32 4873,6 Зв оп 157,6 28 4412,8 Эв Пу - Зв Эв к 14083,52 Эв оп 19614,37-4412,8 15201,57 Экономический эффект на 1 грн. ветеринарных затрат Эгрн Эв Зв Эгрн 9209,92 4873,6 1,89 Эгрн 15201,57 4412,8 3,44 Вывод экономическая эффективность ветеринарных мероприятий на 1 гривну ветеринарных затрат составила в контрольной группе 1,89 грн, а в опытной - 3,44 грн, что оправдывает проведение данных мероприятий. 4.6