Обсуждение результатов собственных исследований. Как известно, низкий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями, в среднем 6-7 лет у крупного рогатого скота, ограничивают генетический прогресс в животноводстве.
В настоящее время эта проблема решается в значительной степени за счет внедрения новых более радикальных методов разведения животных, в частности метода трансплантации эмбрионов.
Значительным недочетом существующей технологии трансплантации является то, что она не предусматривает специальных мероприятий, повышающих приживляемость эмбрионов.
Основной задачей нехирургической эмбриотрансплантации является повышение приживляемости эмбрионов, зависящей от многих факторов, одним из которых является асептичность всех проводимых операций.
На приживляемость эмбрионов оказывает влияние много причин.
В своей работе мы изучали только влияние микробного фактора на приживляемость эмбрионов. Из литературных данных известно, что в процессе эволюции у животных сложились мощные иммунные барьеры, препятствующие инфицированию половых путей микрофлорой.
Основными факторами, обеспечивающими защиту половых путей коров и телок являются барьерные функции слизистых оболочек, особенно шейки матки. Так, цервикальная слизь во время течки и охоты обладает бактерицидным действием В.П.Полищук, 1984 В.С.Шипилов, 1988 . Другие исследователи сообщают, что даже во время течки и половой охоты у многих коров в пробах слизи из шейки матки были обнаружены различные бактерии M. Krisha et al 1974 . Наши бактериологические исследования показали, что в промывных буферных средах даже у здоровых животных были обнаружены ассоциации микроорганизмов E.coli, Staph.aureus, Staph.album, Pseudomonasa Bac.subtilis.
Зная видовой состав микробов промывных буферных сред, который близок к таковому половых путей реципиентов, нами проведены испытания по санации промывных буферных сред и эмбрионов. Как известно из практики искусственного осеменения, для санации спермы используют различные антибиотики и их комбинации.
Применение антибиотиков при эмбриотрансплантации ограничено. Для санации промывных буферных сред А.Д.Бугров и И.М.Величко 1986 использовали гентамицин в комплексе с пенициллинами в концентрации 12 мкг на мл и 100 Ед на мл, соответственно. В своей работе мы испытали три комплекса антибиотиков гентамицин с ампициллином и гентамицин с пенициллином в концентрациях 4, 6, 10 и 12 мкг мл и 100 Ед мл, пенициллин со стрептомицином 100 и 50 Ед мл, рекомендуемый инструкцией по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота.
Лучшими антимикробными свойствами обладали комплексы антибиотиков гентамицин с ампициллином и гентамицин с пенициллином в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл. Концентрация гентамицина 4, 6 и 10 мкг мл хотя и подавляла в комплексе с пенициллинами рост синегнойной палочки, но полной бактерицидной активности не наблюдалось. Комбинация пенициллина со стрептомицином оказалась неэффективной против синегнойной палочки и испытуемого штамма кишечной палочки.
В контрольной среде, без добавления антибиотиков, наблюдали сплошной рост микроорганизмов. Поэтому для санации промывных буферных сред лучше использовать комплекс антибиотиков гентамицин с ампициллином или гентамицин с пеницилином 12 мкг мл и 100 Ед мл. Известно, что многие антибиотики, в частности пенициллин со стрептомицином, оказывают токсическое действие на сперму И.И.Соколовская, 1960 А.П.Волосевич, 1963 С.И.Сердюк и соавт 1970 , ооциты М.Ф.Карашаев, 1987 . Наши исследования показали, что контакт эмбрионов в течение двух часов в среде с комплексом антибиотиков гентамицин с ампициллином 12 мкг мл и 100 Ед мл не оказывает на дальнейшее развитие эмбрионов более существенного влияния, чем комплекс антибиотиков пенициллин со стрептомицином в общепринятых концентрациях 100 и 50 Ед мл. Добавление антибиотиков в промывные буферные среды позволило резко снизить их микробную загрязненность.
Так, из 14 смывов, санированных комплексом антибиотиков гентамицин с ампициллином 12 мкг мл и 100 Ед мл , 12 - были свободны от микроорганизмов 85 , в тоже время в средах без добавления антибиотиков только 42,9 смывов были стерильны.
Аналогичные результаты были получены С.В.Советкиным 1988 , который использовал для санации промывных буферных сред ГАМП гентамицин с ампициллином 50 мкг мл и 50 Ед мл. Наличие или занос микроорганизмов в матку донора может привести к воспалительным процессам, в частности к эндометриту. Добавление антибиотиков в промывные буферные среды является хорошим антимикробным средством, что профилактирует заболевания матки у коров-доноров и позволяет использовать их многократно.
Эмбрионы, извлеченные из промывных буферных сред, в дальнейшем, согласно инструкции, должны проходить еще одну обработку - многократную отмывку в стерильных буферных средах. Наши микробиологические исследования показали, что из 25 проб, отобранных после пятикратного отмывания эмбрионов, в трех пробах наблюдали рост микрофлоры, а при добавлении антибиотиков в среды для отмывки эмбрионов все пробы были стерильными.
Аналогичные результаты были получены С.В.Советкиным 1988 . Существенным качественным параметром развития эмбриона в культуре является образование бластоцеля. В опыте, где была использована среда с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин ампициллин в концентрациях 12 мкг мл и 100 Ед мл, в контроле - среда с антибиотиками пенициллин стептомицин 100 и 50 Ед мл, во втором контроле - среда без добавления антибиотиков 5 из 7 71,4 , 5 из 9 55,5 и 3 из 6 50 эмбрионов развились из стадии морулы поздней МП в бластоцисту раннюю БР 5 из 5 100 , 5 из 5 100 , 2 из 5 40 эмбрионов развились из стадии бластоцисты ранней БР в бластоцисту позднюю БП 5 из 7 71,4 , 5 из 7 71,4 и 3 из 4 75 эмбрионов развились из стадии бластоцисты поздней БП в стадию бластоцисты экспандированной БЭ , соответственно. Различия между опытом и контролем не достоверны Р 0,05 . Полученные данные свидетельствуют о том, что контакт эмбрионов в течение 2-х часов в среде с комплексом антибиотиков гентамицин ампициллин в концентрациях 12 мг мл и 100 Ед мл, соответственно, не оказывает на их дальнейшее развитие более существенного влияния, чем комплекс антибиотиков пенициллин стрептомицин в общепринятых концентрациях 100 и 50 Ед мл. Учитывая большую бактерицидную активность предложенного комплекса антибиотиков по сравнению с комплексом пенициллин стрептомицин можно считать целесообразным его использование для санации промывных буферных сред и эмбрионов в практике эмбриотрансплантации.
Санация промывных буферных сред и отмывка эмбрионов средами с антибиотиками положительно влияли на приживляемость эмбрионов.
Из 28 реципиентов, которым были пересажены эмбрионы, отмытые средами с антибиотиками, 21 телка 75 стала стельной, в контроле без добавления антибиотиков приживляемость составила 50 . Мы считаем, что это происходило благодаря тому, что в матку реципиента вместе с пересаженным материалом эмбрионами вводили небольшое количество среды Дюльбекко с антибиотиками, которые создавали асептические условия в конкретном участке матки.
В технологию по извлечению и пересадке эмбрионов для профилактики микробной контаминации нами были введены элементы, позволяющие повысить приживляемость эмбрионов, включающие 1. санацию половых путей коров-доноров и телок-реципиентов с экспозицией 15 минут перед эмбриотрансплантацией 2. санацию промывных буферных сред комплексом антибиотиков гентамицин с ампициллином в концентрации 12 мкг мл и 100 Ед мл 3. отмывку эмбрионов в среде Дюльбекко с добавлением комплекса антибиотиков гентамицин с ампициллином 12 мкг мл и 100 Ед мл . 5.