Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності

Досліджувані показники

n

M ± m

CV

lim

Споживання кисню, нг-атом О/ 10⁸ сперміїв / хв: спермою

187

17,8 ± 0,55

59,1

5,3 - 60,7

в тому числі: мітохондріальне

187

9,4 ± 0,39

55,8

4,1 - 32,8

азидрезистентне

186

10,9 ± 0,56

70,1

1,3 - 27,2

Відновна активність, мкг К₃…/10⁸ сперміїв/хв

118

8,6 ± 0,97

20,9

0,1 - 26,0

Активність СДГ, мкМ/хв/л

661

11,2 ± 0,21

48,5

0,5 - 55,0

Активність ЦХО, мкМ/хв/л

678

33,1 ± 0,37

29,3

0,5 - 100,0

Вміст, мкг/мл:

аскорбінової кислоти

280

37,3 ± 3,51

69,7

5,0 - 110,0

окиснених продуктів (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот)

280

10,7 ± 1,08

90,7

0,5 - 45,0

загальний (аскорбінової кислоти + окиснених продуктів)

280

47,7 ± 3,31

52,6

5,0 - 150,0

Частини

еякуляту

Вміст доданих речовин, мМ

Поглинання кисню, нг-атом О/ 10⁸сперміїв/хв

Активність ферментів, мкМ/хв/л

СДГ

ЦХО

n

M ± m

n

M ± m

n

M ± m

Контрольна

-

14

20,6±2,86

10

7,4±0,89

10

29,6±1,95

Дослідні:

аскорбінова

кислота (АА)

1,25

14

2 7,6±2,66

Дія аскорбінової кислоти також залежить від внесеної дози. Мінімальний вміст її (1,25мМ) стимулює дихання на 40,0%, підвищує активність СДГ і ЦХО, відповідно, на 12,1 і 33,4%. Підвищення вмісту (більше 2,50 мМ) знижує інтенсивність дихання, порівняно з максимальним значенням, на 14,0-26,0%, активність СДГ на 7,8-33,8% і ЦХО на 0,7-10,0%. Поєднання обох компонентів (АА+Г-SH - 1,25+2,50 мМ) підвищує поглинання кисню на 39,3%, активність СДГ на 118,9% і знижує ЦХО майже в 12 разів.

Аналогічні зміни СДГ і ЦХО за дії антиоксидантів виявлені при вивченні активності ферментів у розмороженій спермі.

Позитивний вплив антиоксидантів у розріджувачі еякулятів зумовлений здатністю Г-SH шунтувати потік електронів як з НАД-залежної, так і кінцевої ланок дихального ланцюга (ЦХО) і забезпечувати альтернативні шляхи їх утилізації (рис. 4). АА, після інгібування дихальної активності сперміїв аміталом, повністю відновлює споживання кисню (до інгібування - 58,712,74 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв, при максимальній дозі - (5,00 мМ) - 60,79,93 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв).

Додавання вказаного антиоксиданта в наростаючих дозах, на фоні дії азида, знижує інтенсивність поглинання кисню в 1,5-3,7 рази.

Інтенсивність споживання кисню сперміями за умов ”окисного навантаження” та наявності антиоксидантів у спермі бугаїв. Вивченням шляхів реалізації впливу антиоксидантів на окисно-відновні процеси в сперміях виявлено, що окиснення SH-груп глутатіону т-БГП, гальмує дихальну і відновну активності статевих клітин, відповідно, на 42,5 і 53,1%.

Це дає підстави стверджувати, що SH-групи глутатіону відіграють важливу роль в енергозабезпеченні сперміїв, їх здатності виживати у зовнішньому середовищі, а ”окисне навантаження”, що виникає в процесі технологічної підготовки еякулятів до заморожування та при розморожуванні знижує інтенсивність обмінних процесів та запліднюючу здатність сперміїв. На фоні дії т-БГП та інгібіторів гліколізу, НАД-залежної і термінальної ланки знижуються, відповідно: споживання кисню - на 15,8%, 16,6% і 28,8%, відновна активність - втричі та на 32,1% і 3,0%. При поєднанні Г-SH+т-БГП і блокуванні гліколізу та НАД-залежної ділянки дихального ланцюга споживання кисню і відновна активність сперміїв вищі, відповідно, на 53,2%, 55,4% і 46,4% та у 10 разів, порівняно з величинами значень при дії т-БГП. З пригніченням термінальної ділянки (ЦХО) дихальна активність залишається вищою на 52,7%, а відновна - не змінюється (0,3±0,03 мкг К₃…/0,1 мл/хв). Аналогічно, споживання кисню сперміями за поєднання АА+т-БГП, після інгібування гліколізу, НАД-залежної і кінцевої ланок дихального ланцюга, вища на 85,1% та у 15 і 34 рази порівняно Г-SH+т-БГП і на 93,3% та у 30 і 60 разів - з т-БГП. Відновна активність також вища, відповідно, на 76,2, 87,1 і 99,0% ніж при поєднанні Г-SH + т-БГП і 87,3-99,0% - за наявності т-БГП.

Подібна закономірність виявлена при аналізі стану електрон-транспортних ланок дихального ланцюга під впливом інгібіторів і присутності субстратів, антиоксидантів та т-БГП. Спермії бугаїв проявляють різну дихальну та відновну активності і визначають цю різницю субстрати й можливі шляхи їх перетворення, здатність акцепторів приймати та передавати електрони вздовж ланцюга дихання або постачати на зовнішньоклітинні акцептори (рис. 7). У повнокомпонентному середовищі (ЛЖГ) з антиоксидантами та т-БГП, змінюються можливості використання альтернативними метаболічними шляхами різних за біохімічними характеристиками сполук, оскільки спермії для забезпечення енергетичних потреб окиснюють більш енергоємкі субстрати (жовток), що призводить до зростання азидрезистентного (немітохондріального) окиснення.

Ефективність використання антиоксидантів у складі розріджувача для заморожування сперми бугаїв. Різні дози АА і Г-SH в розріджувачі виявляють вплив на виживання сперміїв і активність ферментів розмороженої сперми (табл. 3). Однак, якщо максимальний вміст Г-SH (5,00 мМ) в ЛЖГ-середовищі знижує виживання сперміїв на 40 хв (р > 0,05), то підвищення дози АА з 1,25 до 2,50 та 5,00 мМ зумовлює зниження величини названого показника, відповідно, на 25,0, 115,0 та 235,0 хв (р<0,001). При цьому, збільшення дози Г-SH стимулює активність СДГ, відповідно, в 3,1, 12,8 та 24,3 рази. Активність ЦХО знижується, відповідно, на 36,0%, 52,9% та 85,4%. Аскорбінова кислота в дозі 1,25 мМ понижує активність СДГ на 13,7%, а при 2,50 та 5,00 мМ підвищує на 22,7% та 100%, відповідно. На активність ЦХО додавання АА в дозах 1,25 та 2,50 мМ виявляє однаковий вплив (13,4-13,8 мкМ/хв/л), а 5,00 мМ - активність підвищує на 90,4%. Поєднання в розріджувачі АА+Г-SH (відношення 1,25:2,50 мМ) знижує активність СДГ на 21,3%, ЦХО на 27,6%, резистентність та виживання сперміїв, відповідно, на 44,0% та 5,5%, підвищує вміст МДА на 22,7%. При цьому, активність сперміїв як у контрольних, так і дослідних пробах не змінюється і становить 3,6 бала.

Таблиця 3

Виживання сперміїв і активність ферментів у розмороженій спермі з антиоксидантами, n = 19; M ± m

Зміна співвідношення АА+Г-SH в сторону зменшення дози першої (0,35 : 2,50 мМ) забезпечує підвищення виживання сперміїв на 30,1% (р<0,001) і активності СДГ на 11,5%, але знижується ЦХО на 36,2%. Значення інших досліджених показників не відрізняються і знаходяться в межах: рухливість сперміїв - 3,8 бали, резистентність 6,4-8,0 тис, вміст МДА 10,2-10,8 нг/мл. Наступне зменшення вмісту АА (відношення АА : Г-SH - 0,25 : 2,50 мМ) не впливає на фізіологічні і біохімічні показники статевих клітин.

При осіменінні корів і телиць спермою з використанням антиоксидантів у пропорції АА+Г-SH - 0,35:2,50 мМ - заплідненість після першого осіменіння становила в різних господарствах 25,0-76,6%, в контрольній групі тварин 12,5-67,2%, різниця - 9,4-13,3% (рис. 8). Рис. 8. Заплідненість, після першого осіменіння, корів і телиць спермою з використанням антиоксидантів. Господарства: І - Грабово; ІІ - ім. Шевченка; ІІІ - Побужанське

Інтенсивність окисних процесів при дозріванні та капацитації сперміїв бугаїв

Результати досліджень свідчать, що під впливом гомогенату слизової матки, фолікулярної рідини, гепарину, альбуміну сироватки крові бугая, амідопірину, перекису водню доданих до середовищ капацитації, у сперміїв з придатка сімяника відбуваються морфологічні зміни в ділянці акросоми та хвоста і підвищується їх активність (табл. 4). Гіперактивний рух сперміїв супроводжується підвищенням дихання на 100-200%, відновної здатності - 20,0-50,0%, активності Г-6-ФДГ - 9,0-15,3%, СДГ - 16,9-100%, зміною спектру білків.

Таблиця 4

Інтенсивність акросомної реакції сперміїв бугаїв у звязку з середовищами і тривалістю капацитації, n = 15; M ± m

У загальній кількості використаного кисню зростає частка аеробного гліколізу на 24,0-39,0% та інтенсивність транспорту електронів на 29,0-43,0%. Підвищується активність Г-6-ФДГ у сперміях при використанні ГП та ФР, відповідно, на 15,3 і 9,0%. Активність СДГ залежить від факторів капацитації і з ГП підвищується на 16,9%, а з ФР знижується на 30,0-63,3%.

Інтенсивність транспорту електронів через НАД-залежну ділянку ланцюга дихання також залежить від факторів капацитації: найвища при додаванні ФР (57,9%), висока при ГП, АМП та ФСБ (47,3-52,9%), нижча при БСА та H₂О₂ (41,2-42,5%) і найнижча у середовищі з СМ (27,1%). Відновна активність знижується на 34,0% у БСА та на 50,0% АМП і підвищується на 40,0% з ГП. У середовищах капацитації використання інгібітора кінцевої ланки дихального ланцюга виявило інтенсивніше споживання кисню сперміями на 10,0-65,0%, що свідчить про підвищення немітохондріальних окисних процесів. Вища відновна активність сперміїв проявляється у середовищах з ГП та АМП, відповідно, на 25,0 та 50,0% і нижча на 25,0% - із БСА. Виявлена різниця дихальної і відновної активності у звязку з середовищами капацитації вказує на існування різних механізмів стимулювання цього процесу у сперміях.

Поряд з активацією окисних процесів, відбуваються зміни у спектрі розчинних та структурних білків сперміїв. Після зберігання СС при 0 - +4°С, порівняно зі свіжоотриманою, вміст альбуміну знижується на 23,7% у суспензії сперміїв, 16,5% - сперміях, 27,0% - середовищі інкубування, а б-глобулінів - зростає, відповідно, на 15,1, 9,7 та 15,5%. Вміст в-глобулінів зменшується в сперміях на 18,7% і зростає в супернатанті на 22,4%. У статевих клітинах підвищується вміст білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa, а в супернатанті - знижується, з ММ 20,1 і 94,0 кДa - зменшується в сперміях і збільшується у супернатанті. Крім цього, у збережених пробах (сперміях і супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується - від 45,0 до 67,0 кДa.

Фізіологічна та біохімічна характеристика антральної рідини фолікулів, ооцит-продуктивність яєчників корів

Дослідженням фолікулів яєчників корів виявили значну мінливість біохімічних показників. Величини дихальної активності й відновної здатності ооцитів та ооцит-кумулюсних комплексів відрізнялись на 27,0-80,9%; клітин гранульозного шару фолікулів - 8,0-47,9%, Г-6-ФДГ - 24,9-44,7%; у фолікулярній рідині вміст антиоксидантів - 23,1-38,1%, білка, фракцій білків та в їх складі глікопротеїнів - 1,4-32,7%. Наведені коливання величин показників зумовлені фізіологічним станом яєчників, розміром фолікулів, числом клітин гранульозного шару та ооцит-продуктивністю. Так, в яєчниках однакового фізіологічного стану при розмірі фолікула до 4 мм кількість клітин гранульози становить 22-25Ч10⁶ /мл, менше у середніх на 33,0-50,0%, великих - у 2-3 рази. Вказана закономірність спостерігається у фолікулах всіх досліджених яєчників, однак сила впливу одного і того ж фізіологічного стану на кількість клітин гранульози неоднакова: при фолікулярному зростанні - = 0,13, свіжій овуляції - = 0,37, ранньому та пізньому жовтому тілі, відповідно, = 0,34 та 0,41. За послідовної зміни фізіологічного стану яєчників: “фолікулярне зростання”“свіжа овуляція”“раннє”“пізнє” жовте тіло та малому розмірі фолікула кількість клітин гранульози низька за “свіжої овуляції” (22,3±3,26Ч10⁶/мл) і вища на 10,3-13,9% у фолікулах яєчників інших фізіологічних станів; при середньому розмірі - різниця, відповідно, 8,5, 15,1, 5,6%; великому - зменшується на 32,9 та 42,7% і підвищується на 5,8% при зміні фізіологічного стану “раннє”“пізнє” жовте тіло.

Вищою ооцитпродуктивністю характеризуються яєчники корів “раннього” жовтого тіла - 3,4 та “пізнього” - 3,0 ОКК - з одного яєчника, у стані “фолікулярного зростання” та “свіжої овуляції” - 2,4 ОКК. При цьому, незалежно від фізіологічного стану яєчника, найбільше ооцитів відібрано з фолікулів малого розміру (“фолікулярного зростання” - 1,7±0,14; “свіжої овуляції” - 1,3±0,29; “раннього” та “пізнього” жовтого тіла, відповідно, 2,3±0,46 і 2,2±0,32), а з середнього та великого менше на 40,5-77,3% і 77,0-86,4%, відповідно.

Інтенсивність дихання клітин гранульози становить 8,1-25,1 нг-атом О/0,1мл СК/хв, а відновна активність 0,4-2,3 мкг К₃.../мл СК/хв. Використання кисню окремими метаболічними шляхами клітин гранульози залежить від фізіологічного стану та розміру фолікулів. Так, аеробним гліколізом кисню реалізується від 9,9% (середнього фолікула яєчника “фолікулярного зростання”) до 42,3% (малого фолікула яєчника “свіжої овуляції”); НАД-залежною ланкою дихального ланцюга - від 13,3% (малих фолікулів яєчника “раннього” жовтого тіла) до 49,2% (середнього фолікула яєчника “фолікулярного зростання”); ціанідрезистентним шляхом - від 26,9% (середній фолікул “раннього” жовтого тіла) до 55,5% (великий фолікул “раннього” жовтого тіла).

Підвищена дихальна та відновна активність клітин гранульозного шару фолікулів зумовлює їх синтетичну функцію. Зокрема, у малих фолікулах активність

Г-6-ФДГ підвищується при зміні фізіологічного стану яєчника “фолікулярного зростання”“свіжа овуляція” на 33,0% досягаючи максимуму за “раннього” жовтого тіла (18,6±4,61 мкМ НАДФН/мл/хв) і знижується - у період “пізнього” жовтого тіла “фолікулярного зростання”, відповідно, на 17,8 і 29,5%. При середньому розмірі фолікула яєчника “фолікулярного зростання” активність ферменту низька (5,2±1,10 мкМ НАДФН/мл/хв), зростає при “свіжій овуляції” на 57,6% і залишається майже на такому ж рівні за “раннього” і “пізнього” жовтого тіла (7,4-9,3 мкМ НАДФН/мл/хв). У великих фолікулах активність Г-6-ФДГ зростає при зміні фізіологічного стану яєчника: “фолікулярне зростання” “свіжа овуляція” “раннє” “пізнє” жовте тіло, відповідно, на 47,7, 18,4 і 54,5% і знову знижується при “фолікулярному зростанні” на 73,1% (до 4,4±1,58 мкМ НАДФН /мл/хв).

Білки фолікулярної рідини антральних фолікулів яєчників корів. Про інтенсивність синтетичних процесів у період розвитку фолікулів і змін фізіологічного стану яєчника свідчить вміст загального білка та його фракцій у фолікулярній рідині. Вказана зміна зумовлює в більшій мірі відмінності альбумінів ( = 0,29-0,54) та у складі фракції, глікопротеїнів ( = 0,51-0,72) фолікулярної рідини однакових за розміром фолікулів різних за фізіологічним станом яєчників, порівняно з їх вмістом ( = 0,13-0,42 і 0,11-0,44) у різних фолікулах одного фізіологічного стану статевої залози.

Вміст -глобулінів та їх глікопротеїнового компоненту залежить як від фізіологічного стану яєчників, так і розміру фолікула. Проте, від останнього більше залежать глікопротеїни -глобулінової фракції = 0,18-0,53, ніж загальний вміст вказаних білків = 0,10-0,30. Така ж залежність -глобулінів проявляється в звязку з фізіологічним станом яєчника (”фолікулярне зростання””свіжа овуляція””раннє””пізнє” жовте тіло): вища сила впливу на глікопротеїновий компонент (розмір фолікула більше 7мм - = 0,63, 4-7мм - =0,43 і менше 4мм - = 0,53) і слабка - на загальний вміст фракції ( = 0,20-0,30).

У антральній рідині різних за розміром фолікулів однакового фізіологічного стану яєчника кореляційне відношення за -глобулінами для ”фолікулярного зростання”, ”раннього” та ”пізнього” жовтого тіла становить, відповідно, = 0,11, 0,24 та 0,34 і зі ”свіжою” овуляцією = 0,54. При цьому, у вказаній фракції проявляється слабка залежність вмісту глікопротеїнів ( = 0,21-0,27). При послідовній зміні фізіологічного стану яєчника: ”фолікулярне зростання””свіжа овуляція””раннє””пізнє” жовте тіло та розмірі фолікулів більше 4 мм кореляційне відношення за вмістом -глобулінів і глікопротеїнів, відповідно, = 0,53 і 0,34, менше 4мм - = 0,33 і 0,42.

Аналіз сили звязків між -глобуліновою фракцією білка, її глікопротеїновою частиною, у антральній рідині та діаметром фолікулів статевої залози однакового фізіологічного стану свідчить про сильну залежність між ними за свіжої овуляції ( = 0,56 і 0,37). Для вмісту вказаної фракції у фолікулярній рідині при послідовній зміні фізіологічного стану яєчника: ”фолікулярне зростання””свіжа овуляція””раннє””пізнє” жовте тіло та діаметрі фолікула більше 7мм кореляційне відношення становить для загального вмісту = 0,57, глікопротеїнового компонента - = 0,60, 4-7мм, відповідно, = 0,36 і 0,65 та менше 4мм - = 0,13 і 0,66. Отже, в яєчнику ”свіжої овуляції” проявляються високий вміст загального білка (7,1-7,8 г%) і глікопротеїнів у зоні -глобулінів (56,6-68,9 %) та низький - у зоні альбуміну (5,4-11,6%), порівняно з яєчниками інших фізіологічних станів (6,4-7,3 г% та 27,3-35,8 %).

Вміст антиоксидантів в антральній рідині фолікулів та звязок з фізіологічним станом яєчників корів. Інтенсивність окисних процесів регулюється рівнем природних антиоксидантів, що підтверджується їх вмістом та співвідношенням відновлених і окиснених форм у фолікулах. Так, в антральній рідині фолікулів яєчників корів вміст відновленої форми глутатіону становить 17,3-33,7 мг%, аскорбінової кислоти - 10,0-21,2 мкг/мл, окиснених форм, відповідно, 10,0-19,1 мг% і 8,3-14,7 мкг/мл, загального глутатіону - 27,0-51,4 мг%, аскорбінової кислоти з окисненими продуктами - 21,9-34,0 мкг/мл. Найвищий вміст відновлених форм антиоксидантів (Г-SH 24,5-33,7 мг%, АА 12,9-21,1 мкг/мл) у період “пізнього” жовтого тіла. Аналіз відношення між відновленими і окисненими формами антиоксидантів виявив найвищий відсоток АА у великому і середньому фолікулах яєчника “фолікулярного зростання” (68,2-71,4 : 35,4-38,6%), та зниження у фолікулах малого розміру всіх інших фізіологічних станів яєчників (59,9-64,0 : 36,1-50,6%) і найменший у великому фолікулі яєчника “свіжої овуляції” (55,4 : 49,2%). Подібні синхронні зміни з АА, відсотку Г-SH та Г-SS-Г у великому і середньому фолікулах “свіжої овуляції” (53,9-59,1 : 40,9-46,1%) свідчать про тісний звязок між вказаними антиоксидантами. Найвищий вміст Г-SH (69,4±5,32%) виявлено у великому фолікулі яєчника “пізнього жовтого тіла”.

Дихальна та відновна активності ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) корів in vitro. Закономірності розвитку фолікулів, клітин гранульозного шару, підтверджуються інтенсивністю дихання ооцитів. Виявлена обернена залежність між поглинанням кисню ОКК у середовищі Дюльбеко, 199, Іґла і RPMI-1640 та розміром фолікула, пряма - з наявністю і компактністю кумулюсу (великі за діаметром, без кумулюсу - 0,09-0,19, середні, з розпушеним кумулюсом - 0,11-0,30, малі, з компактним кумулюсом - 0,17-0,47 нг-атом О/ооцит/хв). Отже, ооцити з компактним кумулюсом інтенсивно поглинають кисень, що з втратою компактності - знижується. При дослідженні у ФСБ Дюльбеко після інкубування 24 год, ОКК проявляють вищу дихальну активність: з компактним кумулюсом малого фолікула на 17,6%, з розпушеним кумулюсом середнього фолікула - 36,3% і без кумулюсу великого фолікула - 44,4%. Інкубування ооцитів 24 год у середовищах ТС 199 та Іґла призводить до зменшення дихальної активності, порівняно з свіжоотриманими: у ОКК з компактним кумулюсом малого фолікула, у першому - нижча на 10,3%, другому - на 7,7%; з розпушеним кумулюсом з середнього та без кумулюсу з великого фолікулів у обох середовищах майже не змінюється (ТС 199 - 0,20-0,22 і 0,13-0,14; Іґла - 0,24-0,26 і 0,19-0,22 нг-атом О/ооцит/хв). У RPMI-1640 використання кисню ооцитами з компактним кумулюсом малого фолікула також не змінюється (0,45±0,090 нг-атом О/ооцит/хв), але знижується на 30,0% - з розпушеним кумулюсом середнього фолікула та зростає на 15,7% - без кумулюсу великого фолікула.

Вивчення окремих ланок утилізації кисню показало, що у свіжоотриманих ооцитів при інгібуванні гліколізу дихальна активність зростає: у ОКК з розпушеним кумулюсом у 2,4 рази та без кумулюсу в 2,9 рази і знижується з компактним кумулюсом на 23,6%.

ОКК проявляють реакцію-відповідь на доданий АТФ - споживання кисню зростає з розпушеним кумулюсом на 13,4%, з компактним - на 39,9%, ”голі” не реагують. Через 24 год інкубації знижується реакція - відповідь на доданий АТФ у ОКК з розпушеним і компактним кумулюсом на 37,5-40,0%, що свідчить про здатність забезпечувати енергетичні потреби окисненням запасів власних субстратів та підтримувати даний процес за рахунок клітин - симбіонтів (кумулюсу), а при нестачі поживних речовин у середовищах культивування - можливе зворотне постачання їх з ооцита до клітин кумулюсу. НАД-залежна ділянка ланцюга дихання у ”голих” ооцитів не активна, а в ОКК з компактним кумулюсом, використання кисню зростає на 57,2%, з розпушеним - знижується на 79,1%. Сукцинат стимулює споживання кисню ОКК з компактним кумулюсом на 38,4%, з розпушеним на 70,0% та без кумулюсу на 13,0%. Ооцити проявляють значну інтенсивність немітохондріальних окисних процесів (нг-атом О/ооцит/хв): з компактним кумулюсом 0,10±0,006, без кумулюсу - 0,13±0,006 і з розпушеним - 0,27±0,006.

Вивченням окисно-відновних процесів ооцитів у середовищі RPMI-1640 виявлена пряма залежність між компактністю кумулюсу та інтенсивністю дихання ооцитів (ОКК з компактним кумулюсом 0,47±0,08 нг-атом О/ооцит/хв, нижча на 36,2% з розпушеним і найнижча - 0,19±0,05 нг-атом О/ооцит/хв - без кумулюсу) і обернена - з відновною активністю (без акцептора електронів: ОКК з компактним кумулюсом - 16,0±5,55 пкг К₃.../ооцит/хв, а ооцити з розпушеним та без кумулюсу виявляють однакову відновну активність - 18,3 пкг К₃.../ооцит/хв). Встановлена залежність підтверджує симбіотичні взаємодії ооцитів з кумулюсом (гранульозою). Акцептор електронів у середовищі культивування знижує дихальну активність ооцитів з компактним кумулюсом та ”голих”, відповідно, на 29,8% та 68,5%, а з розпушеним - не змінює (0,31±0,11 нг-атом О/ооцит/хв). При цьому, відновна здатність зростає у всіх групах ооцитів: з компактним і розпушеним кумулюсом у 6,4, без кумулюсу - в 11,1 рази. Гальмування активності гліколізу підвищує дихання ооцитів: на 52,4% з компактним кумулюсом та 22,5% розпушеним і зменшує відновну активність, відповідно, на 58,0% і 40,0%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06±0,00 нг-атом О/ооцит /хв), а відновна здатність підвищується на 32,3%. Використання аміталу знижує дихальну активність у ооцитів з компактним кумулюсом на 89,5% і відновну - на 16,7%, з розпушеним кумулюсом, відповідно, на 67,5% і 42,9%. У ооцитів без кумулюсу дихання не змінюється (0,06 нг-атом О/ооцит/хв), а відновна здатність - знижується на 83,4% (до 50,0±34,00 пкг К₃.../ооцит/хв). Отже, при забезпеченні субстратами, ооцити без кумулюсу отримують енергію, головним чином, через гліколіз; з компактним кумулюсом - споживання кисню (генерація АТФ) визначається активністю циклу трикарбонових кислот; з розпушеним кумулюсом займають проміжне місце - підвищений гліколіз та збережене дихання.

При інгібуванні активності ЦХО встановлено у ОКК з компактним кумулюсом істотне підвищення (у 2,4 рази) відновної здатності та зниження використання кисню (до 0,06 нг-атом О/ооцит/хв), з розпушеним - зменшення відновної активності на 85,8% та збільшення споживання кисню на 23,0%. У ооцитів без кумулюсу азид натрію підвищує дихання на 85,0%, а відновну здатність - знижує на 44,6%. При стимулюванні НАДН-редуктазних процесів у ОКК з компактним кумулюсом підвищується споживання кисню (азидрезистентного) та відновна активність, відповідно, на 62,5 та 7,3%; з розпушеним кумулюсом - дихання майже відсутнє (0,09±0,05 нг-атом О/ооцит/хв), а транспорт електронів зростає більше ніж у 12 разів; без кумулюсу - споживання кисню знижується на 75,0%, а відновні процеси - підвищуються на 60,5%. Як наслідок, за рахунок вільнорадикального окиснення жирних кислот, ОКК з компактним кумулюсом споживають 50,0% кисню (азидрезистентного) та транспортують 23,1% відновних еквівалентів; з розпушеним кумулюсом та без кумулюсу - дихальна активність не змінюється, а відновна, відповідно, у перших зростає на 57,2% (до 163,3±24,60 пкг К₃.../ооцит /хв), у других - знижується на 23,9%.

Культивування ембріонів. Використання середовищ культивування (ТС 199, Іґла, RPMI-1640) з додаванням фетальної та еструсної сироваток, антиоксидантів, клітин гранульози, гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів, інсуліну та гепарину забезпечує повноцінний розвиток ембріонів. Ооцити, з компактним кумулюсом запліднюються та розвиваються до бластоцисти, а з іншими морфологічними характеристиками, розвиток до пізніх стадій припиняється. Додавання антиоксидантів 0,01мл на 1мл середовища культивування (суміші відновленої форми глутатіону і аскорбінової кислоти, відповідно, 15,3 і 4,4мг в 1,0мл), проявляє позитивну дію на розвиток ембріонів. Із 79 клітин, через 144 год з моменту запліднення, виявлено 5 ембріонів (6,3%): 4 ранніх і 1 пізня морула. Аналогічні дослідження проведені з використанням середовищ Іґла та RPMI-1640. Отримано ембріонів, відповідно, 5 (7,5%) - 3 ранні і 2 пізні морули із 67 та 6 (8,3%) - 4 ранні і 2 пізні морули із 72 запліднених ооцитів.

Результати досліджень свідчать, що для запліднення ооцитів та вирощування ембріонів найефективніше проводити культивування у два етапи: 1) культивування (16-18 год) і запліднення (16-18 год) ооцитів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять: 10% фолікулярної рідини, 10% еструсної сироватки крові корів, 10% фетальної сироватки крові, клітини гранульозного шару фолікулів, 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Заміну середовища проводити перед заплідненням та після 16-18-годинного спільного культивування ооцитів і сперміїв; 2) культивування ембріонів у середовищах ТС 199, Іґла, RPMI-1640, які містять, крім вище перерахованих компонентів, 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів. Заміну середовища проводити через кожні 48 год протягом культивування.

Розділення періоду культивування на два окремі етапи і, відповідно, використання гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки в складі середовищ вирощування сприяє розвитку ембріонів до стадії бластоцисти. Найкраще розвиваються ембріони в середовищі RPMI-1640. За 10 діб культивування отримано 18,4% бластоцист і в тому числі 7,2% без прозорої оболонки. Менше бластоцист при культивуванні в середовищах Іґла та ТС 199, відповідно, 28 (14,9%) і 17 (11,0%). З них без прозорої оболонки, відповідно, 11 (5,8%) та 2 (1,3%).

Окисно-відновні процеси в бластоцистах корів. В процесі розвитку ембріони використовують кисень та проявляють відновну здатність. Існує пряма залежність стадій розвитку бластоцист з дихальною активністю (ранні бластоцисти 0,09±0,01 нг-атом О/ембріон/хв, на 10,0% вище у пізніх, максимальна у бластоцист без прозорої оболонки - 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон /хв) і обернена - з відновною (ранні - 37,0±9,00 пкг К₃…/ембріон/хв, у пізніх нижча на 21,7% і у бластоцист без прозорої оболонки найнижча - 13,0±2,01 пкг К₃…/ембріон/хв).

Вивченням особливостей використання кисню ембріонами виявлено, що гальмування гліколізу стимулює дихальну активність у ранніх бластоцист на 29,1%, пізніх на 40,2%, у бластоцист без прозорої оболонки - у два рази. При цьому, швидкість відновлення фериціаніду у перших та других зменшується, відповідно, на 69,1% та 56,6%, у третіх - підвищується на 20,7% (63,0±32,0 пкг К₃.../ембріон /хв). Отже, у ранніх та пізніх бластоцист, відповідно, 69,1 та 56,6% і без прозорої оболонки - не більше 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються в позаклітинний простір.

При інгібуванні НАД-залежної ділянки дихальна активність бластоцист знижується: ранніх стадій, пізніх та без прозорої оболонки, відповідно, на 66,3, 43,8 та 65,7%. Відновна здатність також знижується у перших на 17,9%, других на 10,5%, а без прозорої оболонки - підвищується більше ніж у два рази (150,0±25,07 пкг К₃.../ембріон/хв). Аналогічно, зі зміною стадії розвитку ембріонів до бластоцисти без прозорої оболонки знижується азидрезистентна компонента дихання з 67,7% до 29,1% та відновна активність на 38,7% і 28,4%.

Інгібітор вільнорадикального окиснення жирних кислот (NaEДTA) гальмує споживання кисню у бластоцист на ранній та пізній стадіях, відповідно, на 59,1% і 67,3%, без прозорої оболонки - на 37,5% (від спожитого кисню азидрезистентною компонентою дихання). Наведені дані свідчать, про наявність в ембріонів альтернативних оксидазних і оксигеназних процесів.

ВИСНОВКИ

У дисертації узагальнено роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченні фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вивчено перебіг та регуляцію окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, ооцитів - у процесі дозрівання та після запліднення - росту ембріонів, виявлені чинники, які забезпечують оптимальне співвідношення процесів окиснення та відновлення у статевих клітинах, встановлені маркери інтенсивності вказаних процесів. На підставі результатів досліджень, розроблені практичні пропозиції з обєктивного і вірогідного оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекції інтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo та ооцитів - in vitro.

1. Спермії свіжоотриманих еякулятів чорно-рябих бугаїв молочних порід характеризуються такими біохімічними та фізіологічними показниками: інтенсивність використання кисню 5,3-60,7 нг-атом О/10⁸ сперміїв/хв, швидкість відновних процесів 0,1-26,0 мкг К₃…/10⁸сперміїв/хв, активність СДГ 0,5-55,0 мкМ/хв/л, ЦХО 0,5-100,0 мкМ/хв/л, вміст фракцій білків - альбуміну 5,5-38,9%, глобулінів: - 15,1-69,1%, - 4,0-32,1%, - 12,2-54,0%, аскорбінової кислоти 5,0-110,0 мкг/мл, продуктів окиснення (дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот) 0,5-45,0 мкг/мл та сумарний вміст 5-150,0 мкг/мл. Величини біохімічних і фізіологічних показників проявляють значну мінливість внаслідок індивідуальних особливостей плідників, черговості отримання еякулятів, сезону року, віку, походження бугаїв, інших факторів.

2. У спермі бугаїв існують позитивні кореляції сильні ( = 0,70-0,74) та середньої сили ( = 0,46-0,65) між інтенсивністю використання кисню, мітохондріальною та азидрезистентною компонентами, активністю окисних ферментів. Неоднозначна сила взаємозвязків між корелюючими біохімічними показниками свідчить про інтенсивність окисно-відновних процесів і визначає фізіологічні показники сперміїв. Сильна кореляція ( = 0,70-0,71) між активністю СДГ, ЦХО і фізіологічними показниками сперміїв дає підстави до використання обох ферментів для оцінювання якості та запліднювальної здатності сперміїв свіжоотриманих і розморожених еякулятів бугаїв.

3. У спермі бугаїв існує оптимум окисно-відновних процесів та показників, а саме, дихальна активність 17,3-20,9 нг-атом О/10⁸сперміїв/хв, її компоненти: мітохондріальна 8,5-10,4 та азидрезистентна 9,9-12,7 нг-атом О/10⁸сперміїв /хв, активність ЦХО 31,8-36,7 і СДГ 14,9-17,5 мкМ/хв/л, вміст аскорбінової кислоти і продуктів окиснення 41-50 і менше 10 мкг/мл, альбуміну 15-20%, глобулінів: - 30-50%, - і - менше, відповідно, 15 і 25%. Оптимум вказаних процесів і показників характерний для еякулятів за обємом 2,0-6,0 мл, концентрацією сперміїв 0,60-1,40Ч10⁹ /мл і кількістю живих 60-80%, що забезпечують виживання сперміїв у свіжоотриманих еякулятах (+46,5°C) 72,7-126,5 хв, розморожених (+38°С) 312,0-373,9 хв, резистентність, відповідно, 22,5-44,5 і 11,3-32,4 тис.

4. ”Окисне навантаження” в еякулятах бугаїв зменшує використання кисню сперміями та відновну активність, підвищує чутливість ланок дихального ланцюга до інгібіторів. Відновлена форма глутатіону нівелює вплив т-БГП на окисно-відновні процеси у сперміях, стимулює їх інтенсивність при окисненні ендо- та екзогенних субстратів, забезпечує захист від факторів зовнішнього середовища та зберігає метаболічну активність енергогенеруючих ланок. Аскорбінова кислота, стимулює транспорт електронів у дихальному ланцюзі і окисні процеси не повязані з синтезом АТФ. Аскорбінова кислота чи відновлена форма глутатіону, додані по 2,50 мМ або у поєднанні (аскорбінова кислота : відновлена форма глутатіону) 1,25+2,50 мМ до свіжоотриманої розбавленої сперми, забезпечують у процесі інкубування за температури + 46,5°С показники виживання сперміїв 77,1-94,3 хв та збереженості 33,2-48,7%. Аскорбінова кислота та відновлена форма глутатіону 0,35:2,5 мМ додані до розріджувача сперми, підвищують запліднювальну здатність сперміїв.

5. Інкубування сперміїв, отриманих із придатка сімяника, у середовищі з гомогенатом слизової матки корови, фолікулярною рідиною, гепарином забезпечує максимальну кількість їх з морфологічними та біохімічними показниками, характерними для акросомної реакції та капацитації: втрачається розділення між акросомою та головкою, інтенсивно поглинають кисень та зростають інтенсивність мітохондріального та немітохондріального дихання, відновна здатність, підвищується активність Г-6-ФДГ, СДГ (активних сперміїв). Значні коливання величин досліджуваних показників у звязку з факторами капацитації свідчать про відмінності сперміїв до дозрівання in vitrо і різну запліднювальну здатність.

6. У процесі інкубування сперми та капацитації сперміїв знижується вміст альбуміну на 2,6-23,7% і -глобулінів на 5,9%, підвищується - -глобулінових фракцій на 0,5-15,3%. Зміни білкового спектру свіжоотриманої інкубованої сперми залежать від величин показників якості еякулятів і активності СДГ. Для капацитованих сперміїв характерне зростання вмісту білків з ММ 14,4, 30,0, 67,0 і більше 94,0 кДa та зменшення - 20,1 і 94,0 кДa. У збережених пробах (сперміях і супернатанті) знижується вміст білків у зонах ММ від 30,0 до 45,0 та від 67,0 до 94,0 кДa і підвищується - від 45,0 до 67,0 кДa.

7. Висока ооцитпродуктивність характерна для яєчників “раннього” та “пізнього” жовтого тіла (3,0-3,4 ОКК з одного яєчника) і менша (2,4 ОКК) - “фолікулярного зростання” та “свіжої овуляції”. Існує сильна позитивна кореляція ( = 0,81) між кількістю вилучених ооцитів і розміром фолікулів менше 4мм.

8. У фолікулярній рідині яєчників корів вміст загального білка становить 6,4-7,8 г%, альбумінів 33,6-44,5%, глобулінів (%): б- 9,5-14,1, в- 13,8-18,5, г- 30,0-42,3, глікопротеїнів у складі фракцій: альбуміну 5,4-33,1% і глобулінів: б- 12,7-28,4, в- 13,9-21,7, г- 27,3-60,4. Величини наведених показників у фолікулярній рідині залежать від розміру фолікулів ( = 0,10-0,72) та фізіологічного стану яєчників корів ( = 0,11-0,66). Яєчник зі “свіжою” овуляцією характеризується високим вмістом - глобулінів 32,4-42,3% і глікопротеїнів 56,6-68,9%.

9. Активність клітин гранульози становить: дихальна - 8,1-25,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв, відновна - 0,4-2,3 мкг К₃... /мл СК/хв. Значення показників залежать від розміру фолікулів і становлять: дихальна - малий фолікул 8,1-18,1; середній - 8,2-17,0; великий - 8,7-13,5 нг-атом О/0,1мл СК/хв і відновна, відповідно, 0,7-2,3; 0,6-1,9; 0,4-0,7 мкг К₃... /мл СК/хв. Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози залежить від фізіологічного стану яєчників корів. Енергетичні потреби клітин гранульози, в залежності від розміру фолікулів та фізіологічного стану яєчників корів, забезпечуються гліколізом на 9,9-42,3% і диханням - 27,2-47,6%. Із загальної кількості використаного кисню 26,5-55,5% припадає на ціанід-(азид-) резистентне дихання.

10. Інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози характеризує розвиток та дозрівання ооцитів у яєчниках корів: “очікування“ - низькі величини дихання (8,1-8,8 нг-атом О/0,1мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти (0,2-0,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв) і відновної здатності (0,6-0,8 мкг К₃.../мл СК/хв) у яєчнику “свіжої овуляції”; “дестабілізації” - зростання дихання (до 13,5-25,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв) та ціанідрезистентної компоненти (до 1,0-3,4 нг-атом О/0,1мл СК /хв), відновної здатності (до 0,7-2,3 мкг К₃.../мл СК/хв) - “раннє” жовте тіло; “стабілізації” - збереження високих значень споживання кисню (12,2-18,1 нг-атом О/ 0,1мл СК/хв), зниження відновної здатності (0,7-0,9 мкг К₃.../мл СК/хв), NаЕДТА-компоненти дихання (0,1-0,4 нг-атом О/0,1мл СК/хв) - “пізнє” жовте тіло; “гальмування” - зниження дихання (8,8-15,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв), ціанідрезистентної компоненти (0,2-2,9 нг-атом О/0,1мл СК/хв), відновної здатності (0,4-1,2 мкг К₃.../мл СК/хв), зростання NаЕДТА-чутливої компоненти дихання (1,0-1,6 нг-атом О/0,1мл СК/хв) - “фолікулярне зростання”. На ранніх етапах розвитку фолікула клітини гранульози виявляють більший вплив на ооцит у звязку зі значним використанням субстратів для росту. З нагромадженням поживних речовин відбувається зворотна реакція, що зумовлює інгібуючий вплив ооцита на інші клітини.

11. Антральна рідина фолікулів корів характеризується вмістом відновлених форм глутатіону 17,3-33,7 мг% і аскорбінової кислоти - 10,0-21,2 мкг /мл, окислених, відповідно, 10,0-19,1 мг% і 8,3-14,7 мкг/мл. Загальний вміст становить: глутатіону - 27,0-51,4 мг%, аскорбінової кислоти з продуктами окиснення - 21,9-34,0 мкг/мл. Переважна частина загального глутатіону (78,7%) та його відновленої форми (68,2%) локалізовані у клітинах із антральної рідини, а аскорбінової кислоти (76,0%) та загальний вміст (86,9%) - у фолікулярній рідині. Вищі значення абсолютних величин глутатіону та аскорбінової кислоти у малих фолікулах яєчників забезпечують інтенсивний міжклітинний обмін і ріст ооцитів. У великому та середньому фолікулах яєчника “свіжої овуляції” вміст відновленої форми глутатіону 53,9-59,1%, окисненої 40,9-46,1%, аскорбінової кислоти і продуктів окиснення, відповідно, 55,4-57,6% і 49,2-47,5%, свідчить про нагромадження цитотоксичних сполук в екзо- і ендоцелюлярному просторі клітин, що негативно впливає на якість ооцитів і придатність їх для використання в репродуктивній біотехнології.

12. Інтенсивність дихання ооцит-кумулюсних комплексів становить (нг-атом О/ооцит/хв) у середовищі Дюльбеко - 0,12±0,03, ТС 199 - 0,22±0,04, Іґла - 0,27±0,04 та RPMI-1640 - 0,32±0,06. Звязок між компактністю кумулюсного оточення та інтенсивністю поглинання кисню ооцитами у вказаних синтетичних середовищах свідчить про їх здатність використовувати ендо- і екзогенні субстрати та АТФ при культивуванні. Середовище RPMI-1640 забезпечує інтенсивне дихання ооцитів після вилучення із фолікулів і через 24 год інкубування.

13. Використання середовища RPMI-1640 з гомогенатом слизової верхньої третини рогу матки корови і виконання робіт у два етапи: 1) культивування та запліднення ооцитів, 2) вирощування ембріонів - забезпечує одержання великої кількості життєздатних ембріонів корів і повноцінний розвиток їх до стадії бластоцисти.

14. Окисно-відновні процеси бластоцист характерні такими показниками: використання кисню - ранніми 0,09±0,01, пізніми 0,10±0,03, без прозорої оболонки 0,11±0,02 нг-атом О/ембріон/хв, відновна активність, відповідно, 37,0±9,00, 29,00±12,10 та 13,0±2,01 пкг К₃.../ембріон/хв. Величини значень наведених показників залежать від стадій розвитку: пряма залежність - між стадією розвитку бластоцист та інтенсивністю споживання кисню і, обернена - зі швидкістю відновлення фериціаніда. У ранніх та пізніх бластоцист від 69,1 до 56,6%, а у бластоцист без прозорої оболонки - 21,0% потоку електронів генеруються гліколізом і транспортуються у позаклітинний простір.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. З метою обєктивного, прискореного оцінювання і прогнозування запліднювальної здатності сперми бугаїв проводити у лабораторіях племпідприємств визначення кількості живих сперміїв полярографічним методом з використанням інгібітора мітохондріального дихання, а також активності сукцинатдегідрогенази чи цитохромоксидази у свіжоотриманій або розмороженій спермі. Для забезпечення високої ефективності штучного осіменіння корів і телиць відбирати еякуляти з показниками активності сукцинатдегідрогенази не нижче 15,0 мкМ/хв/л чи цитохромоксидази не нижче 30,0 мкМ/хв/л.

2. Для збереження життєздатності, підвищення виживання і запліднювальної здатності сперміїв у процесі підготовки сперми бугаїв до заморожування використовувати у розріджувачі аскорбінову кислоту і відновлену форму глутатіону у відношенні 0,35 : 2,5 мМ (61,6 мг аскорбінової кислоти : 765 мг відновленої форми глутатіону на 1000 мл розріджувача).

3. Для створення належних умов дозрівання ооцитів корів in vitro, запліднення та отримання ембріонів відбирати ОКК з компактним кумулюсом фолікулів діаметром менше 7 мм з яєчників фізіологічного стану ”раннього” та ”пізнього” жовтого тіла, що забезпечує оптимальну інтенсивність окисно-відновних процесів, використання енергетичних субстратів середовищ.

4. Для підвищення ефективності роботи з репродуктивної біотехнології процеси культивування, запліднення ооцитів та вирощування ембріонів проводити у два етапи: культивування (16-18 год) і запліднення (16-18 год) у середовищі RPMI-1640, з додаванням до нього: 10% фолікулярної рідини, 10% еструсної сироватки крові корів, 10% фетальної сироватки крові, клітин гранульозного шару (5-7 Ч 10⁶/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,03% інсуліну (0,13 од/мл), 0,001% гепарину (5 од/мл). Заміну середовища проводити перед заплідненням та після 16-18 годинного спільного культивування ооцитів і сперміїв. Вирощування бластоцист проводити в середовищі RPMI-1640, до якого, крім вказаних компонентів, додавати 10% гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки корів. Заміну середовища проводити через кожні 48 годин протягом культивування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

МОНОГРАФІЇ, БРОШУРИ І ДОВІДНИКИ

1. Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині (видання третє, перероблене і доповнене). Довідник / В. В. Влізло, Р. С. Федорук, І. А. Макар, І. Б. Ратич, Л. І. Сологуб, В. Г. Янович, ... Д. Д. Остапів та ін. Ї Львів: Інститут біології тварин, 2004. Ї 400 с. (Дисертант написав методики досліджень сперми до розділу 11.Ї С. 257-263.)

2. Остапів Д. Д. Способи оцінювання якості еякулятів бугаїв та підвищення запліднювальної здатності сперміїв / Д. Д. Остапів // Методичні рекомендації. Ї Київ, 2008. Ї 24 с.

СТАТТІ У НАУКОВИХ ВИДАННЯХ

3. Чухрій Б. М. Колориметричний спосіб визначення активності сукцинатдегідрогенази в спермі бугаїв / Б. М. Чухрій, Л. О. Клевець, Д. Д. Остапів // Вісник аграрної науки. Ї 1995. Ї № 11. Ї С. 73-76. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, оформленні роботи до друку).

4. Остапів Д. Д. Роль антиоксидантів в кисень-залежних процесах сперміїв /

Д. Д.Остапів, О. В. Лап ін // Збірник праць співробітників Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів і кормових добавок. Ї Львів, 1996. Ї С. 27. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів експерименти, узагальнив результати досліджень, оформив роботу до друку).

5. Хомин С. П. Вікова динаміка вмісту аскорбінової кислоти в спермі бугаїв / С. П. Хомин, Д. Д. Остапів, С. Й. Кава // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 1998. Ї Вип. 1. Ї С. 65-68. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив та описав результати досліджень ).

6. Остапів Д. Д. До методики вивчення глікопротеїнів і білків електрофорезом в поліакриламідному гелі (ПААГ) / Д. Д. Остапів // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. Ї Львів, 1998. Ї С. 225-227.

7. Остапів Д. Д. Стан дихального ланцюга овоцит-кумулюсних комплексів / Д. Д. Остапів // Розведення і генетика тварин. Ї 1999. Ї Вип. 31Ї32. Ї С. 170-172.

8. Остапів Д. Д. Середовища капацитації та окисно-відновні процеси в сперміях бугаїв // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2000. Ї Т. 2., Ч. 2. Ї С. 211-214.

9. Остапів Д. Д. Інтенсивність окисно-відновних процесів у спермі бугаїв під впливом антиоксидантів / Д. Д. Остапів, С. П. Хомин, С. Й.Кава, В. І. Міщенко // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2000. Ї Т. 2., Ч.1. Ї С. 217-220. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень).

10. Остапів Д. Д. Кисень-залежні процеси в клітинах гранульози з фолікулів яєчників корів / Д. Д. Остапів // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2001. Ї Т. 3., № 3. Ї С. 86-88.

11. Остапів Д. Д. Активність глюкозо-6-фосфат- і сукцинат-дегідрогеназ та окисно-відновні процеси при капацитації сперміїв / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. Ї Львів, 2001. Ї Вип. 1Ї2. Ї С. 248-250.

12. Остапів Д. Д. Фізіологічний стан яєчника й інтенсивність окисно-відновних процесів у клітинах гранульози / Д. Д.Остапів, Н. В. Остапів // Передгірське та гірське землеробство і тваринництво. Ї Львів-Оброшино, 2001. Ї Вип. 43., Ч. ІІ. Ї С. 124-128. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень, оформив роботу до друку).

13. Остапів Д. Д. Дихальна активність клітин гранульози / Д. Д. Остапів, Н. В. Остапів // Вісник Дніпропетровського державного аграрного університету. Ї Дніпропетровськ, 2001. Ї № 2. Ї С.129. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень).

14. Остапів Д. Д. Фізіологічний стан яєчника і вміст антиоксидантів у антральній рідині фолікулів / Д. Д. Остапів, Н. В. Остапів // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2002. Ї Т. 4., № 5. Ї С. 163-166. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень, описав та оформив роботу до друку).

15. Остапів Д. Д. Активність глюкозо-6-фосфат дегідрогенази в клітинах гранульози / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. Ї Львів, 2002. Ї Вип.4., № 2. Ї С. 111-114.

16. Остапів Д. Д. Фізіологічний стан та овоцит-продуктивність яєчників корів / Д. Д. Остапів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького. Ї Львів, 2003. Ї Т.5, №3, Ч.2. Ї С. 74-77.

17. Остапів Д. Д. Роль антиоксидантів у енергетичному обміні сперміїв бугаїв / Д. Д. Остапів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2003. Ї Т.5, № 3, Ч.2. Ї С. 78-82.

18. Остапів Д. Д. Вплив зберігання сперміїв бугаїв, отриманих із придатка сімяника, на електрофоретичні спектри розчинних білків / Д. Д. Остапів // Біологія тварин Ї 2003. Ї Т.5., № 1,2. Ї С. 203-207.

19. Остапів Д. Д. Спосіб підрахунку живих сперміїв в еякулятах бугаїв / Д. Д. Остапів // Аграрна наука - виробництву: Науково-інформаційний Бюлетень завершених розробок УААН.Ї Київ, 2003. Ї № 3. Ї С. 24.

20. Остапів Д. Д. Активність сукцинатдегідрогенази при капацитації сперміїв бугаїв / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. Ї Львів, 2004. Ї Вип. 5. Ї № 3. Ї С. 161-166.

21. Остапів Д.Д. Окисно-відновні процеси в ооцитах корів / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН. Ї Львів, 2004. Ї Вип. 5., № 1, 2. Ї С. 161-166.

22. Остапів Д. Д. Середовища культивування та розвиток зигот / Д. Д. Остапів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2004. ЇТ.6, № 3, Ч. 3. Ї С. 165-171.

23. Остапів Д. Д. Інтенсивність окисно - відновних процесів у зиготах корів / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН та Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів і кормових добавок. Ї Львів, 2005. Ї Вип. 6., № 2. Ї С.169-173.

24. Остапів Д. Д. Окисно-відновні процеси в еякулятах бугаїв при окиснювальному навантаженні та додаванні антиоксидантів / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН та Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів і кормових добавок. Ї Львів, 2005. Ї Вип. 6., № 3. Ї С.280-284.

25. Остапів Д. Д. Роль субстратів та антиоксидантів у окисно-відновних процесах сперміїв при окисному навантаженні / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН та Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів і кормових добавок. Ї Львів, 2006. Ї Вип. 7., № 1,2. Ї С. 86-92.

26. Остапів Д. Д. Характеристика якості еякулятів та сперміїв бугаїв / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту тваринництва. Ї Харків, 2006. Ї № 94. Ї С.250-255.

27. Остапів Д. Д. Дихальна активність ооцит-кумулюсних комплексів корів in vitro / Д. Д. Остапів // Науковий вісник Львівського національного університету ветеринарної медицини і біотехнологій імені С. З. Ґжицького. Ї Львів, 2007. Ї Т.9. Ї №3. (34), Ч. 2. Ї С.142-147.

28. Остапів Д. Д. Дихальна і відновна активність сперміїв бугаїв / Д. Д. Остапів // Вісник Інституту тваринництва центральних районів УААН. Ї Дніпропетровськ, 2007. Ї Вип. 2. Ї С. 68-74.

29. Остапів Д. Д. Оцінювання якості яєчників та ооцитів корів для використання у репродуктивній біотехнології / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин УААН та Державного науково-дослідного контрольного інституту ветеринарних препаратів і кормових добавок. Ї Львів, 2007. Ї Вип. 8., №3,4. Ї С.171-174.

30. Остапів Д. Д. Капацитація та акросомна реакція сперміїв бугаїв придатка сімяника in vitro: біохімічний та біотехнологічний аспекти / Д. Д. Остапів // Біологія тварин. Ї 2007. Ї Т. 9., №1Ї2. Ї С. 244-250.

31. Остапів Д. Д. Якість та запліднювальна здатність сперміїв бугаїв за дії антиоксидантів / Д. Д. Остапів // Науково-технічний бюлетень Інституту тваринництва. Ї Харків, 2008. Ї № 96. Ї С. 306-312.

СОУ І ПАТЕНТИ

32. Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв : СОУ 1.42-37-6171: 2007. - [Чинний від 2007-01-11].

33. Пат. 20900 Україна, А 61D7/02. Спосіб захисту сперміїв при заморожуванні еякулятів / Д. Д. Остапів, Л. О. Клевець, О. Г. Ващишин, С. Й. Кава.; заявник і патентовласник Інститут землеробства і тваринництва західного регіону УААН. - № 96124651 ; заявл. 13.12.96; опубл. 07.10.97. - Бюл. № 5. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів патентний пошук та з методичною допомогою Клевець Л. О. лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень, оформив патент).

34. Деклараційний патент на винахід 31972 Україна, 6А61D7/02. Спосіб визначення кількості живих сперміїв в еякулятах бугаїв / Остапів Д. Д.; заявник і патентовласник Львівська академія ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького. - № 981226318 ; заявл. 01.12.98; опубл. 5.12.2000. - Бюл. №7 (ІІ ч.).

35. Деклараційний патент на корисну модель 63867 Україна, А61D19/00. Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку / Остапів Д. Д.,

Влізло В. В.; заявник і патентовласник Інститут біології тварин УААН. - № 20040705755 ; заявл. 13.07.04; опубл. 16. 05. 05. Бюл. № 5. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів патентний пошук та експерименти, узагальнив результати досліджень, оформив патент)

36. Пат. 75953 Україна, A61В 10/00, A61В 10/02, G01N 1/28, G02B 21/34/ Спосіб виготовлення гістологічних препаратів овоцитів і зигот ранніх стадій розвитку / Влізло В. В., Остапів Д. Д.; заявник і патентовласник Інститут біології тварин УААН. - № 2004032194 ; заявл. 25.03.04; опубл. 15.06.06, Бюл. № 6. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів патентний пошук та експерименти, узагальнив результати досліджень, оформив патент).

МАТЕРІАЛИ НАУКОВИХ КОНФЕРЕНЦІЙ

37. Остапів Д. Д. Інтенсивність окисно-відновних процесів у спермі бугаїв при внесенні антиоксидантів у розріджувач / Д. Д. Остапів // Всеукраїнська конференція з фізіології і біохімії тварин. Ї Львів, 1994. Ї С. 102.

38. Остапів Д. Д. Вміст неорганічного сульфату в раціонах бугаїв і якість сперми / Д. Д. Остапів, Л. О. Клевець // Генетико-селекційні та технологічні проблеми відтворення с.- г. тварин : науково-практична конференція 19-20 травня 1994 р. : тези доповідей. Ї К., 1994. Ї С. 68. (Дисертант організував дослід, провів з методичною допомогою Клевець Л. О. лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень, оформив роботу до друку).

39. Остапив Д. Д. Сульфгидрильные группы и глутатион в сперме быков и качество половых клеток / Д. Д. Остапив // Всеросийская научная и учебно-методическая конференция по аккушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных. Ї Воронеж, 1994. Ї С. 179-180.

40. Остапив Д. Д. Содержание аскорбиновой кислоты в сперме быков / Д. Д. Остапив, А. Г. Ващишин А.Г., С. Й. Кава // Ветеринарные и зооинженерные проблемы животноводства : 1 международная научно-практическая конференция, 28-29 ноября 1996 г. : материалы. Ї Витебск, 1996. Ї С.197. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження і узагальнив результати досліджень, оформив роботу до друку).

41. Остапів Д. Д. Інтенсивність дихання сперміїв бугаїв і ооцит-кумулюсних комплексів корів // Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва : міжнародна конференція, 9-11 жовтня 1997 р. : збірник статей. Ї Львів, 1997. Ї С. 370-372.

42. Остапів Д. Д. Білковий склад еякулятів і якість статевих клітин бугаїв / Д. Д. Остапів // Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва : міжнародна конференція, 9-11 жовтня 1997 р. : збірник статей. Ї Львів, 1997. Ї С. 369-370.

43. Остапів Д. Д. Окисно-відновні процеси при капацитації статевих клітин / Д.Д. Остапів // Міжнародна конференція присвячена памяті професора Шостаковської І. В. : міжнародна конференція, 11-12 жовтня, 2002 р. : матеріали. Ї Львів, 2002. Ї С.35.

44. Остапів Д. Д. Дихальна активність ооцитів корів та клітин гранульозного шару фолікулів у звязку з фізіологічним станом яєчника / Д. Д. Остапів // Механізми функціонування фізіологічних систем : міжнародна конференція, приурочена до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені Івана Франка, 8-11 листопада 2006 р. : матеріали. Ї Львів: Видавничий центр ЛНУ імені Івана Франка, 2006. Ї С. 113-115.

45. Остапів Д. Д. Роль антиоксидантів у окисному метаболізмі сперміїв / Д.Д. Остапів, В.В. Влізло // ІХ Український біохімічний зїзд, 24-27 жовтня, 2006 р. : матеріали // Український біохімічний журнал. Ї 2006. ЇТ.1. Ї С. 198. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, провів лабораторні дослідження, узагальнив результати досліджень, оформив роботу до друку).

АНОТАЦІЯ

Остапів Д. Д. Окисно-відновні процеси в статевих клітинах бугаїв і корів, способи оцінювання якості та підвищення запліднюваності. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, Львів, 2008.

Вивчена роль окисно-відновних процесів у формуванні та забезпеченні фізіологічних показників якості і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв in vivo та in vitro, дозріванні ооцитів, їх заплідненні та розвитку ембріонів корів in vitro. Вказане наукове завдання вирішено шляхом експериментального дослідження перебігу та регуляції окисно-відновних процесів при дозріванні і капацитації сперміїв поза організмом, а ооцитів - у процесі дозрівання та після запліднення - росту ембріонів. Виявлені чинники, які характеризують співвідношення між окисненням та відновленням у статевих клітинах, встановлені маркери їх інтенсивності. На підставі отриманих результатів досліджень, розроблені способи оцінювання якості статевих клітин бугаїв і корів, корекції інтенсивності окисно-відновних процесів у сперміях та ооцитах, підвищення запліднювальної здатності сперміїв, запліднення корів і телиць in vivo, ооцитів - in vitro. Розроблені та підтверджені у виробничих умовах „Спосіб захисту сперміїв бугаїв при заморожуванні” та „Спосіб визначення кількості живих сперміїв у еякулятах бугаїв”. Вдосконалено способи оцінювання якості та запліднюючої здатності сперміїв за активністю ферментів дихального ланцюга - сукцинатдегідрогеназою та цитохромоксидазою. Розроблено СОУ 1.42-37-6171:2007 ”Велика рогата худоба. Оцінювання якості еякуляту і запліднювальної здатності сперміїв бугаїв”. Розроблено високоефективне середовище для вирощування ембріонів поза організмом корів „Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій in vitro”.

Ключові слова: окисно-відновні процеси, антиоксиданти, фізіологічні та біотехнологічні методи, капацитація, запліднення in vitro, спермій, ооцит, ембріон, бугай, корова.

АННОТАЦИЯ

Остапив Д. Д. Окислительно-восстановительные процессы в половых клетках быков и коров, способы оценки качества и повышения оплодотворяемости. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С. З. Ґжицкого, Львов, 2008.

Изучена роль окислительно-восстановительных процессов в формировании и обеспечении физиологических показателей качества и оплодотворяющей способности спермиев быков in vivo и in vitro, созревании ооцитов, их оплодотворении и развитии эмбрионов коров in vitro. Указанная проблема решена путём экспериментального исследования течения и регуляции окислительно- восстановительных процессов при созревании и капацитации спермиев вне организма, а ооцитов - в процессе созревания и после оплодотворения - роста эмбрионов.

Выявлено, что эякуляты быков характеризируются высокими значениями потребления кислорода, активности окислительных ферментов, содержания аскорбиновой кислоты и продуктов ёё окисления. Аналогичные результаты получены при изучении фолликулярной жидкости яичников коров. При сравнительно высоких средних значениях величины биохимических показателей проявляют значительные колебания. Изменчивость значений вышеуказанных показателей в сперме быков обусловлена зрелостью спермиев в эякуляте, индивидуальными и породными особенностями быков, разницей между первым и вторым эякулятами, полученных последовательно в один день и в разные дни от одного и того же быка, сезоном года. В яичниках коров причины вариабельности значений биохимических показателей - физиологическое состояние половой железы и размер фолликула.

Анализом корреляций выявлены факторы, характеризирующие соотношение между окислением и восстановлением, установлены маркеры их интенсивности. Выявлена сильная положительная корреляция между активностью сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, потреблением кислорода спермой, его митохондриальной и азидрезистентной компонентами, физиологическими показателями и оплодотворяющей способностью спермиев.

Изучением влияния аскорбиновой кислоты и глутатиона на потребление кислорода, активность окислительных ферментов, а также физиологические показатели (выживаемость и резистентность) и оплодотворяющую способность спермиев установлено оптимальное соотношение указанных антиоксидантов в разбавителе эякулятов быков.

Изучением капацитации спермиев, полученных из придатка семенника, установлено, что инкубация половых клеток в средах с гомогенатом слизистой оболочки матки коровы, фолликулярной жидкостью, гепарином обеспечивает максимальное их количество с морфологическими и биохимическими показателями, характерными для акросомной реакции и капацитации: сглажевается разделение между акросомой и головкой, половые клетки интенсивно потребляют кислород, повышается активность немитохондриального (азидрезистентного) дыхания, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы. В процессе инкубации спермы и капацитации спермиев происходят изменения в содержании как растворимых фракций белков, так и отдельных протеинов.

Клетки гранулёзы обладают дыхательной и восстановительной способностью, величины значений которых зависят от физиологического состояния яичника и размера фолликула. Ооциты коров также обладают дыхательной и восстановительной способностью. Величина их значений зависит от наличия у ооцитов кумулюса и его состояния.

Дыхательной и восстановительной способностью характеризируются эмбрионы коров. Установлена прямая зависимость интенсивностью потребления кислорода от стадии развития бластоцист и, обратная - со скоростью восстановления феррицианида. У ранних и поздних бластоцист от двух третьих до половины, а у бластоцист без прозрачной оболочки - 21,0% потока электронов генерируются гликолизом и транспортируются во внеклеточное пространство.

На основании полученных результатов исследований, разработаны способы оценки качества половых клеток быков и коров, коррекции интенсивности окислительно-восстановительных процессов в спермиях и ооцитах, повышение оплодотворяющей способности спермиев, оплодотворения коров и тёлок in vivo и ооцитов - in vitro. Разработаны и проверены в условиях производства „Способ защиты спермиев быков при замораживании” и „Способ определения количества живых спермиев в эякулятах быков”. Усовершенствованы способы оценки качества и оплодотворяющей способности спермиев по активности ферментов дыхательной цепи - сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы. Разработаны СОУ 1.42-37-6171:2007 ”Крупный рогатый скот. Оценка качества эякулята и оплодотворяющей способности спермиев быков”, а также высокоэффективная среда для выращивания эмбрионов вне организма коров „Среда для выращивания зигот коров ранних стадий in vitro”.

Ключевые слова: окислительно-восстановительные процессы, антиоксиданты, физиологические и биотехнологические методы, капацитация, оплодотворение in vitro, спермий, ооцит, эмбрион, бык, корова.

ANNOTATION

Ostapiv D. D. Redox processes in the gametes of bulls and cows, methods of quality evaluation and fertilization increase. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of agricultural sciences doctor by the specialty 03.00.13 - Human and animal physiology. - S. Z. Gzhytski Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology, Lviv, 2008.

Dissertation is devoted to the role of redox processes in forming and providing physiological indicies of quality and impregnation capacity of spermatozoa of bulls in vivo and in vitro ripening of oocytes, their impregnation and development of embryos of cows in vitro. This scientific task was fulfilled by the experimental investigation of flow and regulation of redox processes at ripening and capacitacion spermatozoa in vitro, and oocytes - in the process of ripening and after the impregnation - growth of embryos. The factors, providing and characterizing balance between that oxidation and regeneration in gametes, intensity markers were foundout. With the use of the obtained results of theoretical researches, practical methods of evaluation of bulls and cows gametes quality and correction of redox processes intensity in spermatozoa and oocytes, increase of fertilization of spermatozoa and impregnation of cows and heifers in vivo and oocytes - in vitro were developed. „The methods of bulls spermatozoa protection at freezing” and „The methods of determination of living spermatozoa amount in bulls ejakulate” are developed and experimentally tested. The methods of evaluation of quality and impregnating capabilitiy of spermatozoa at activity of enzymes of respiratory chain - succinic dehydrogenase and cytohrome oxydase were improved. SOU 1.42-37-6171:2007 ”Cattle. Evaluation of ejakulate quality and impregnating ability of bulls spermatozoa” was elaborated. High efficient environment for growing embryos out of cows organism „The environment for cows zygote growing at early stages in vitro” was developed.

Keywords: redox processes, antioxidants, physiological end biotechnological methods, capacitacion, fertility in vitro, spermatozoa, oocyte, embryo, bulls, cow.