Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини

5

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

ГІЛЬЧУК Юлія Миколаївна

УДК 577.21 : 577.213.3 : 577.215

577.217 : 577.218

ЕФЕКТИ, ОБУМОВЛЕНІ ВВЕДЕННЯМ У КЛІТИНИ ССАВЦІВ ТРАНСГЕНА АПОЛІПОПРОТЕЇНУ А-1 ЛЮДИНИ

03.00.22 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ ? 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України, академік АМН України

Кордюм Віталій Арнольдович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Строковська Людмила Іванівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімічної генетики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович,

Інститут геронтології АМН України, керівник лабораторії молекулярної та клітинної біології.

Захист дисертації відбудеться «24» червня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано « 24 » травня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні роки інтенсивно розвиваються дослідження, які спрямовані на корекцію певних генетичних дефектів введенням цільових генів у клітини реципієнта - генна терапія (ГТ) (Verma et al., 2005). ГТ, як напрямок, сформувалася на перетині молекулярної генетики та медицини і спочатку була зосереджена на лікуванні спадкових моногенних захворювань, таких, як дефіцит аденозиндезамінази, муковісцидоз, гемофілія, дефіцит б-1 антитрипсину та інших (Patil et al., 2005). На сьогодні генно-терапевтичні дослідження поширились на полігенні та інфекційні захворювання; більше 60 % клінічних випробувань ГТ стосуються терапії злоякісних пухлин, велика кількість зусиль спрямована на лікування синдрому набутого імунодефіциту (Edelstein et al., 2007). Для медичного використання схвалено перший препарат «Gendicine» (SiBiono Genetech, Китай) (Pang et al., 2005) для лікування різних форм раку.

Прикладом полігенного захворювання, для якого інтенсивно розробляють схеми генно-терапевтичної корекції на стадії доклінічних досліджень, є атеросклероз. Атеросклероз ? одне із найпоширеніших захворювань у світі, проявами якого є звуження просвіту судин внаслідок порушення метаболізму ліпідів та, як наслідок, обмеження кровообігу до життєво важливих органів (Оганов и соавт., 2002). Першим кандидатом для ГТ атеросклерозу людини є ген основного білка ліпопротеїдів високої густини (ЛПВГ) ? аполіпопротеїну А-1 (АРОА1) (Eckardstein et al., 2001).

Основними проблемами як для підходів генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, так і загалом для ГТ, є необхідність підвищення ефективності та тривалості функціонування в організмі рекомбінантних векторів, які містять терапевтичний ген, зниження їхньої токсичності, імуногенності та інших можливих негативних ефектів.

Для доставки гена АРОА1 людини in vivo вже використовували рекомбінантні вірусні вектори, комплекси плазмід із такими носіями, як модифікований полі-L-лізин, ліпосоми та інше. У роботах (Oka et al., 2007; Lebherz et al., 2007) авторами з використанням рекомбінантних аденовірусних векторів (рАд) та векторів на основі адено-асоційованого вірусу (рААВ) показано можливість забезпечення високого рівня синтезу АРОА1 людини у піддослідних мишей, який утримувався після одноразового введення вектора майже два роки. У той же час, застосування вищезазначеної системи рАд векторів для ГТ атеросклерозу на кролях продемонструвало низьку ефективність (Snoeys et al., 2007; Lievens et al., 2004). Використання рекомбінантних вірусних векторів для повторюваних введень цільового гена часто неефективне через продукування нейтралізуючих антитіл (Monhan et al., 2000; Amalfitano et al., 2002). Крім того, безпечність використання вірусних векторів є нагальною проблемою ГТ та робить актуальним розробку саме невірусних засобів доставки цільових генів.

З іншого боку, спроби доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з використанням таких носіїв, як галактолізований полі-L-лізин (Диже и соавт., 2001; Перевозчиков и соавт., 1997), забезпечили низький рівень експресії трансгена, хоча було показано ефективність повторних інєкцій препаратів. Введенням гідродинамічною інєкцією плазмідної ДНК вдалось досягнути у десятки разів вищого рівня експресії АРОА1 людини у піддослідних тварин (Акифьев и соавт., 2004) порівняно з зазначеними раніше носіями. Однак, зазначений метод переносу ДНК є небажаним для ГТ атеросклерозу людини, особливо, для пацієнтів із серцево-судинними захворюваннями.

Одним із найефективніших носіїв для доставки плазмідних векторів in vivo є поліетиленімін (ПЕІ) (Boussif et al., 1995). Однак, при введенні комплексів ДНК/ПЕІ внутрішньовенною ін`єкцією експресію трансгена виявляють переважно у тканинах легенів (Goula et al., 1998). З іншого боку, описано чимало випадків ефективного переносу плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ при локальному введенні препарату (Goula et al., 1998). Рівень експресії введених у клітини ссавців генів залежить від багатьох чинників, у тому числі і від сили елементів регуляції транскрипції трансгена. У випадку необхідності забезпечення високого рівня експресії трансгена перспективним вважається його розміщення у векторі під контролем сильних промоторів.

Таким чином, актуальним є вивчення експресії гена АРОА1 людини in vitro та in vivo при введенні рекомбінантної плазмідної ДНК у комплексі з ПЕІ, а також встановлення впливу на рівень експресії гена АРОА1 людини сильних гібридних промоторів.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках плану фундаментальних досліджень відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.3. „Вивчення на модельних обєктах очікуваних терапевтичних ефектів, обумовлених введенням рекомбінантних молекул” (№ державної реєстрації 0103V000075, 2003-2007 pp.).

Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітинами СНО-К1 гена АРОА1 людини, який знаходиться у складі рекомбінантних плазмід під регуляцією різних сильних промоторів, вивчення експресії, тривалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин.

Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:

1. Створити рекомбінантні плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (hCMV-ІA) та енхансеру середньораннього гена цитомегаловірусу людини, промотору та першого інтрону гена в-актину курчати (CAG), для експресії в клітинах ссавців in vitro та in vivo.

2. Одержати трансфіковані клітини культури клітин яєчників китайського хомяка (СНО-К1) при використанні невірусного методу доставки цільової плазмідної ДНК.

3. Дослідити експресію гена АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1, одержаними для різних рекомбінантних плазмід.

4. Розробити експериментальну модель для дослідження експресії трансгена АРОА1 людини in vivo.

5. Дослідити експресію гена АРОА1 людини, локалізацію та тривалість його знаходження в організмі піддослідних тварин при використанні невірусного методу доставки цільової ДНК.

Обєктом дослідження є експресія трансгена АРОА1 людини in vitro та in vivo, локалізація та тривалість знаходження трансгена в організмі піддослідних тварин.

Предметом дослідження є ген АРОА1 людини, що знаходиться в рекомбінантних плазмідах під контролем різних елементів регуляції транскрипції.

Методи дослідження - мікробіологічні (нарощування і культивування бактерій, трансформація бактерій), генно-інженерні (полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), зворотна транскрипція, виділення і рестрикційний аналіз плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних ДНК, гель-електрофорез ДНК), молекулярно-біологічні (експресія білків), імунохімічні (ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA), Вестерн-блот аналіз), біохімічні (електрофорез білків), мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини (hCMV-ІЕ), hCMV-ІA та CAG. Вперше показано можливість доставки рекомбінантних плазмід із геном АРОА1 людини у клітини ссавців інєкцією комплексів плазмідна ДНК/ПЕІ у паренхіму печінки. Вперше досліджено характер локалізації та тривалість знаходження гена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин при введенні плазмідної ДНК у складі комплексів з ПЕІ.

Практичне значення одержаних результатів. Одержано стабільно трансфіковані клони культури клітин СНО-К1, що продукують білок АРОА1 людини. Оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини у плазмі крові трансфікованих тварин. Результати дослідження можуть бути використані при розробці підходів до генно-терапевтичної корекції атеросклерозу, заснованої на використанні невірусної системи доставки цільової ДНК.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, отримано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема, автором самостійно створено рекомбінантні плазміди, оптимізовано умови детекції наявності гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах ссавців, оптимізовано методи імунохімічної детекції АРОА1 людини in vitro та in vivo. Виділення та очищення плазмідної ДНК, виділення тотальної хромосомальної ДНК з клітин ссавців, ПЛР та імунохімічне дослідження експресії гена АРОА1 людини виконані безпосередньо здобувачем. Роботи із культивування культури клітин СНО-К1, одержання транзиторно експресуючих та стабільно трансфікованих клітин СНО-К1, проводились спільно з м.н.с. Т. А. Рубан та н.с. О. М. Сухорадою. Розрахунок схем конструювання рекомбінантних плазмід та розрахунок праймерів було проведено спільно із м.н.с. Д. М. Іродовим. Роботи, повязані із піддослідними тваринами проводили у співробітництві з Інститутом геронтології АМН України. Розробка програми вирішення поставлених завдань, аналіз і обговорення одержаних результатів досліджень проведені спільно з м.н.с. Д. М. Іродовим, д.мед.н. С. Н. Новіковою, м.н.с. О. К. Топоровою, а також завідувачем відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України, академіком АМН України В. А. Кордюмом, з якими автор має спільні публікації.

Автор висловлює подяку науковому керівнику д.б.н., професору, чл.-кор. НАН України, академіку АМН України В. А. Кордюму за корисні поради та критичні зауваження, а також всім співробітникам, які сприяли її виконанню.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах та зїздах: XXX Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Аахен, Німеччина, 2003), Конференції, присвяченій 50-річчю відкриття подвійної спіралі ДНК (Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, Україна, 2003), Установчому зїзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна, 2004), XXXI Щорічному міжнародному конгресі Європейського товариства штучних органів (Варшава, Польща, 2004), Конференції молодих вчених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006» (Інститут біохімії імені О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна, 2006), ХІV Щорічному міжнародному конгресі європейського товариства генної терапії (Афіни, Греція, 2006), а також на наукових семінарах відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та тези 6 доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, які представлені у 5-ти розділах, аналізу та узагальнення результатів, списку використаних джерел (328 найменувань). Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту та проілюстровано 35 рисунками і 4 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. В роботі використано штами Escherichia coli (E. coli) DH10B, Sure II. Дослідження проводили на культурах клітин СНО-К1 і СПЕВ, щурах лінії Вістар та кролях породи Шиншила.

Для конструювання векторів експресії використовували плазміди pTRhCMV-IEapo (Топорова і співав., 2004), pBacMam-1 «Novagen» (США), pTR-GT60 (Кордюм і співав., 2003), pTRUFneo^R- та pTRUF, які були люб`язно надані С. Золотухіним (Gene Therapy Center Vector Core Lab, США), pBluSKM («Fermentas», Литва), pTR-EGFP (Кордюм і співав., 2004).

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію фрагментів ДНК, гідроліз ДНК рестриктазами, лігування ДНК, ПЛР) виконували згідно зі стандартними методами (Sambrook et al., 1989). Тотальну ДНК клітин виділяли за допомогою набору реактивів «Genomic DNA Purification kit» («Fermentas»). У процедурах молекулярного клонування застосовували ферменти виробництва «Fermentas». Тотальну ДНК/РНК з клітин печінки та крові тварин виділяли набором реактивів Рибо-золь А («Амплісенс», Російська Федерація). ДНК в пробах гідролізували за допомогою дезоксирибонуклеази 1 («Sigma»). Синтез кДНК проводили з використанням набору реактивів «Реверта L-100» («Амплісенс»).

Трансфекцію клітин ссавців in vitro та in vivo здійснювали за допомогою розгалуженого ПEI (25 кДа, «Aldrich» (США)). Препарат ДНК/ПЕІ готували у масовому еквіваленті 1:2, додаючи при перемішуванні розчин ПЕІ до розчину плазмідної ДНК.

При трансфекції до 5•10⁵ клітин СНО-К1 вносили 5 мкг препарату плазмідної ДНК/ПЕІ. Відбір стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 проводили на середовищі F10, що містить 20 % ембріональної телячої сироватки та 1 мг/мл антибіотика G418. Аналіз наявності білка АРОА1 у культуральному середовищі трансфікованих клітин СНО-К1 здійснювали методами ELISA, дот-блот та Вестерн-блот аналізу з використанням моноклональних антитіл MGH Laa («ИМТЕК», Російська Федерація).

Препарат ДНК/ПЕІ вводили ін`єкцією в паренхіму печінки піддослідних тварин: по 100 мкг та 240 мкг ДНК на тварину ? щурам та кролям, відповідно. Введення препарату тваринам проводили при ультразвуковому дослідженні або при операції. Всі процедури проводили з використанням анестезуючих препаратів, згідно загальноприйнятих міжнародних правил поводження з тваринами. Аналіз наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів здійснювали Вестерн-блот аналізом із використанням моноклональних антитіл 3F10 («ICN»,США). Кролям, які утримувались на холестериновій дієті щодня орально вводили 1,5 % розчин холестерину у рослинній олії з розрахунку 1 мг холестерину / кг ваги тварини. Визначення концентрації тотального холестерину у плазмі крові тварин проводили з використанням набору реактивів фірми «Sentinel Diagnostics» (Італія) та «Elitech Diagnostics» (Франція). Препарати тканин органів кролів готували згідно загальноприйнятих методів (Лили, 1969). Зрізи тканин забарвлювали розчинами гематоксиліну та еозину за Ван-Гізоном.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Statistica 6.0.

Результати досліджень та обговорення. Для корекції дефіциту певного білка в організмі необхідно підтримувати таку концентрацію цільового білка, що відповідає його фізіологічній нормі або має терапевтичний ефект. При цьому для кожного білкового продукту ця концентрація буде індивідуальною. Фізіологічна концентрація АРОА1 у плазмі крові людини становить - 1,47±0,17 мг/мл (Bekaert et al., 1993). Таким чином, для корекції атеросклерозу необхідне досягнення високого рівня експресії трансгена АРОА1 людини.

Конструювання рекомбінантних плазмід для експресії АРОА1 людини in vitro та in vivo. На сьогодні створено велику кількість гібридних промоторів, які мають вищу швидкість ініціації транскрипції порівняно з промотором hCMV-IE. Продемонстровано, що введення до складу вектора експресії деяких геномних елементів, зокрема, інтронів та 3`- і 5`- послідовностей, які не транслюються, підвищує рівень експресії трансгена як in vitro (Palmiter et al., 1991) так і в трансгенних тваринах (Ebert et al., 1998). Механізм впливу таких послідовностей на рівень експресії трансгенів не в усіх випадках відомий, але його пов`язують з такими явищами, як підвищення частоти ініціації транскрипції, стабільності і ефективності транспорту і/або підвищення ефективності формування 3`-кінця мРНК при її дозріванні (Kawamoto et al., 1998). Тому, одним із перспективних шляхів підвищення рівня експресії трансгена є використання послідовностей, що містять не лише промотор, а також і перший інтрон гена, транскрипцію якого регулює даний промотор чи промотор іншого гена, у випадку гібридних послідовностей. В експериментах із використанням маркерних генів показано, що послідовності CAG та hCMV-ІA забезпечують вищий рівень синтезу трансгена in vitro порівняно з hCMV-IE (Niwa et al., 1991; Chapman et al., 1991; Xia et al., 2006). З використанням цих промоторів одержано трансгенні тварини (Okabe et al., 1997; Ishii et al., 1997) та здійснено експресію трансгенів in vivo (Xu et al., 2001). Враховуючи дані літератури, використання цих елементів регуляції транскрипції видається перспективним для підвищення рівня експресії трансгена АРОА1 людини в клітинах ссавців.

Як трансген у роботі використано повнорозмірний геномний варіант гена АРОА1 людини (рис. 1).

Для оцінки впливу вищезазначених гібридних послідовностей на експресію гена АРОА1 людини крім вихідної плазміди pTRhCMV-IEapo, яку створено співробітниками нашого відділу раніше (Топорова і співав., 2004), було сконструйовано рекомбінантні плазміди pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo. Для конструювання вектора експресії pTRCAGapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE було замінено на CAG. Для одержання цільової плазміди pTRhCMV-IAapo в плазміді pTRhCMV-IEapo промотор hCMV-IE було замінено на hCMV-ІA.

Для вивчення рівня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1, до складу плазмід pTRhCMV-IEapo, pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo було клоновано ген неоміцинфосфотрансферази (neo^R), який дозволяє відбирати клітини на селективному середовищі з антибіотиком G418 та отримано плазміди pTRhCMV-IEapo neo^R, pTRCAGapo neo^R, pTRhCMV-IAapo neo^R.

Транзиторна експресія гена АРОА1 клітинами СНО-К1. Нами було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різних елементів регуляції транскрипції транзиторно та стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1.

Перевагами використання транзиторної системи експресії є незалежність рівня експресії трансгена від «ефекту положення», тобто впливу регуляторних хромосомних елементів, оскільки експресія трансгена відбувається з неінтегрованих послідовностей. Дослідження рівня транзиторної експресії трансгена трансфікованими клітинами СНО-К1 проводили після трансфекції клітин препаратами ДНК/ПЕІ з рекомбінантними плазмідами: pTRhCMV-IEapo, pTRCAGapo та pTRhCMV-IAapo, що містять у своєму складі ген АРОА1 людини.

Наявність плазмідної ДНК у трансфікованих клітинах визначали на 6-ту добу після трансфекції за допомогою методу «nested» ПЛР. Для проведення ПЛР використовували розраховані нами за допомогою програми Vector NTI Advance 10 пари праймерів Ap-r/Ap-f та Ap(n)-f /Ap(n)-r (Гільчук та співав., 2006).

Синтезований АРОА1 людини секретується клітинами і тому його визначення проводили безпосередньо у культуральному середовищі. Для цього використовували таку схему: через добу після трансфекції змінювали середовище на безсироваткове, на наступну добу середовище повністю відбирали та зберігали при -20 ⁰С, а до клітин додавали свіже середовище без сироватки. Таким чином були відібрані проби культурального середовища на 2-5 добу після проведення трансфекції клітин.

На 2-гу добу після трансфекції Вестерн-блот аналізом було показано наявність АРОА1 людини в культуральному середовищі клітин трансфікованих рекомбінантними плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-IAapo (рис. 2).

Встановлено, що рівень синтезу АРОА1 клітинами, трансфікованими плазмідою pTRhCMV-IAapo, складає ~ 3 нг білка/мл середовища за добу, в той час, як при трансфекції клітин плазмідою pTRhCMV-IEapo - ~ 0,4 нг/мл. Рівень експресії трансгена, що контролюється гібридною послідовністю CAG, був нижчий за чутливість використаного методу аналізу (< 0,2 нг/мл).

Експресія гена АРОА1 стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1. Для порівняння сили промоторів, крім транзиторної експресії трансгена у низці випадків досліджують експресію у пулі стабільно трансфікованих клітин (Xia et al., 2006). Це дозволяє вилучити з аналізу клітини, в які при трансфекції не потрапив цільовий ген. З іншого боку, оскільки експресія трансгена відбувається з інтегрованих векторних послідовностей її рівень залежить від „ефекту положення”. Для зменшення впливу ефекту положення трансгена на рівень його експресії, досліджується експресія пулом стабільно трансфікованих клітин, а не окремими клонами.

Для дослідження синтезу АРОА1 людини у стабільно трансфікованих клітинах було проведено трансфекцію клітин СНО-К1 препаратами ДНК/ПЕІ з плазмідами: pTRhCMV-IEapo neo^R, pTRCAGapo neo^R та pTRhCMV-IAapo neo^R. Трансфіковані клітини відбирали на селективному середовищі, яке містило антибіотик G418. Після двох тижнів селективного відбору клітин, які були трансфіковані окремо кожною з плазмід, отримано не менш ніж 100 клонів стабільно трансфікованих клітин.

Оскільки селекцію клітин після трансфекції проводили лише за геном neo^R, важливо було встановити наявність гена АРОА1 людини в трансфікованих клітинах. Наявність трансгена визначали в пулі трансфікованих клітин ампліфікацією з різної кількості тотальної ДНК. При цьому визначали мінімальну кількість тотальної ДНК, продукт ампліфікації якої ще виявляли за допомогою електрофорезу. Встановлено, що різні пули стабільно трансфікованих клітин містять приблизно однакову кількість копій АРОА1 людини на клітину (рис. 3).

Для порівняння рівня експресії трансгена з різних регуляторних елементів у пулах стабільно трансфікованих клітин у чашки Петрі переносили по 1·10⁶ клітин, отриманих для кожної з одержаних рекомбінантних плазмід. Через добу середовище замінювали на безсироваткове, а через дві доби відбирали для аналізу. Аналіз проводили для пулів стабільно трансфікованих клітин (надалі стабільно трансфіковані клітини). Вміст АРОА1 у культуральному середовищі визначали методом ELISA (рис. 4).

Кількісний аналіз вмісту АРОА1 у культуральному середовищі проводили також Вестерн-блот аналізом (рис. 5). Встановлено, що рівні експресії гена АРОА1 людини клітинами, трансформованими pTRhCMV-IEapo neo^R, pTRCAGapo neo^R та pTRhCMV-IAapo neo^R, становили 156 нг/мл, 253 нг/мл та 634 нг/мл, відповідно. Одержані результати свідчать, що стабільно трансфіковані клітини СНО-К1, які були отримані для плазмід pTRCAGapo neo^R та pTRhCMV-IAapo neo^R, забезпечують вірогідно вищий рівень синтезу трансгена, порівняно з рівнем отриманим для pTRhCMV-IEapo-neo^R.

Аналіз тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини in vivo. Важливим етапом при розробці генно-терапевтичних підходів до корекції генетичних дефектів людини є проведення експериментів на тваринах для встановлення таких характеристик системи доставки трансгена, як специфічність, ефективність, безпечність та інші.

Виходячи з результатів, одержаних на культурі СНО-К1, плазміда pTRhCMV-IAapo забезпечує найвищий рівень експресії гена АРОА1 людини порівняно з іншими сконструйованими нами плазмідами. Однак, із даних літератури відомо, що характер експресії з промоторів може відрізнятись для різних типів клітин, та для досліджень in vitro та in vivo (Xu et al., 2001; Xu et al., 2002). Тому, проводити вибір рекомбінантної плазміди для розробки підходу до ГТ атеросклерозу можливо лише після досліджень in vivo. Крім того, невідомо, який рівень експресії цільового білка можливо забезпечити запропонованим нами методом генно-терапевтичної корекції дефіциту АРОА1 людини in vivo та чи достатній цей рівень для отримання очікуваного терапевтичного ефекту. Тому перші експерименти на тваринах in vivo нами проводились з метою дослідження як характеристик запропонованої нами системи доставки трансгена (тривалість зберігання трансгена, його локалізація в організмі), так і для вивчення можливого рівня експресії гена АРОА1 людини в організмі кролів та здійснювався з використанням базової плазміди - pTRhCMV-IEapo.

Для дослідження тривалості знаходження трансгена АРОА1 людини, в організм піддослідних тварин інєкцією в паренхіму печінки вводили препарат плазміди pTRhCMV-IEapo. При цьому кількість плазмідної ДНК, яку вводили тваринам (щур - 100 мкг, кріль - 240 мкг), була максимально можлива для цього методу, та обмежена сумарним обємом препарату, який можливо ввести в паренхіму печінки тварин без видимих її пошкоджень. Тривалість зберігання трансгена в організмі аналізували за його наявністю у фракції тотальної ДНК тканин печінки через різні проміжки часу після введення плазміди pTRhCMV-IEapo. Аналіз проводили методом «nested» ПЛР з використанням пар праймерів Ap-f/Ap-r, Ap(n)-f/Ap(n)-r та Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r, Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r), розрахованих нами для виявлення ДНК АРОА1 людини на фоні тотальної ДНК клітин щура та кроля, відповідно (Гільчук та співав., 2006).

Ген АРОА1 людини виявлено в клітинах печінки всіх щурів піддослідної групи на 3-ю та 25-у добу після інєкції, у той час, як при подальшому аналізі на 90-у добу, трансген не виявлений в усіх проаналізованих тварин (табл. 1). Одержаний результат може свідчити про те, що у зазначений період часу після інєкції препарату ДНК/ПЕІ відбуваються процеси, що призводять або до зменшення у клітинах плазмідної ДНК до рівня, який нижчий за чутливість методу аналізу, або до загибелі трансфікованих клітин. Варто зазначити, що в усіх випадках трансген виявляли лише за результатом другого раунда ампліфікації, однак при цьому спостерігали гетерогенність проб за кількістю синтезованого амплікону та за наявністю чи відсутністю продукту першого раунда ампліфікації.

Таблиця 1

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки щурів, визначена методом «nested» ПЛР

Дослідження наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК клітин печінки кролів виявило тривале збереження цільової ДНК в клітинах (табл. 2). Так, трансген виявляли і на 85-у добу після введення ДНК, в той час, як на 150-у добу АРОА1 людини не детектували. Через годину після введення плазмідної ДНК у паренхіму печінки трансген був детектований у першому раунді «nested» ПЛР, в той час, як в усі наступні часові періоди його наявність детектували за продуктами другого раунда ампліфікації. При цьому не спостерігали значної гетерогенності за кількістю продуктів ампліфікації, що можна значною мірою пояснити особливістю аналізу наявності гена АРОА1 людини саме з використанням пар праймерів Ap(h-Rab)-f/Ap(h-Rab)-r та Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r: було показано інгібування другого раунда ПЛР з використанням прймерів Ap(h-PigRab)-f/Ap(h-PigRab)-r при більшій за 10⁶ кількості копій цільової ДНК у реакційній суміші.

Таблиця 2

Тривалість знаходження трансгена АРОА1 у тотальній ДНК клітин печінки кролів, визначена методом «nested» ПЛР

Встановлення локалізації введеного трансгена in vivo. Дослідження розповсюдження плазмідної ДНК в органах піддослідних тварин проводили на щурах та кролях, яким інєкцією в паренхіму печінки вводили препарат ДНК/ПЕІ. Тварин забивали на 6-у та 85-у добу після інєкції плазміди pTRhCMV-IEapo. Для проведення аналізу відбирали у щурів проби тканин печінки, серця, легенів та нирок, а у кролів, окрім цих органів ? також лімфатичні вузли та стінку аорти.

За допомогою підібраних для кожної з тварин наборів праймерів проведено «nested» ПЛР аналіз наявності гена АРОА1 людини у тотальній ДНК, що була виділена з тканин різних органів щурів та кролів. За результатами другого раунда «nested» ПЛР встановлено наявність трансгена в усіх проаналізованих зразках тканин тварин (табл. 3) (чутливість «nested» ПЛР у присутності ДНК щура 10 копій гена АРОА1 людини/500 нг ДНК, у присутності ДНК кроля ? 10³ копій гена/500 нг ДНК). Це свідчить про ефективність доставки плазмідної ДНК інєкцією in vivo у складі комплексів ПЕІ/ДНК.

Таблиця 3

ПЛР аналіз розповсюдження в організмі піддослідних тварин гена АРОА1 після введення плазмідної ДНК

Примітки: + трансген виявлено; - трансген не виявлено; н/п - дослідження не проводили.

Результати аналізу локалізації трансгена in vivo показали, що частина плазмідної ДНК, яку було введено в печінку, потрапляє з міжклітинною рідиною та лімфою, або через капіляри з венозною кровю, у кровообіг, і таким чином, розповсюджується по організму. Але в даному випадку, методом ПЛР, важко визначити, чи потрапляє плазмідна ДНК у клітини тканин інших органів (серце, легені, нирки, лімфовузли), чи виявляється лише плазмідна ДНК, яка знаходиться у крові в капілярах цих органів або у клітинах ендотелію судин. Звичайно, при локальному введенні плазмідної ДНК з катіонними ліпідами спостерігають зберігання переважної кількості трансгена біля місця введення (Eliyahu et al., 2007), що з високою вірогідністю вірно і для комплексів ДНК/ПЕІ. Однак, використаний нами для аналізу локалізації трансгена метод «nested» ПЛР, з метою підвищення чутливості аналізу, не дозволяє робити висновок щодо кількісного розподілу введеної плазміди та відображає лише якісно здатність трансгена потрапляти до певних тканин організму після введення плазміди запропонованим нами методом.

Дослідження синтезу АРОА1 та очікуваного терапевтичного ефекту при повторних введеннях плазміди pTRhCMV-IEapo тваринам. Вивчення ефектів, обумовлених введенням трансгена АРОА1 людини in vivo здійснювали на експериментальній моделі атеросклерозу, яку одержували при утримуванні кролів на холестериновій дієті. Відомо, що метаболізм ліпопротеїдів кролів більш подібний до метаболізму людини порівняно з метаболізмом мишей та щурів (Moghadsian et al., 2001). Саме тому кролі з експериментально індукованим атеросклерозом є адекватною моделлю для вивчення ефектів від введення трансгена людини на метаболізм ліпопротеїдів та сприйнятливості до атеросклерозу. При утриманні кролів на холестериновій дієті вже на другий тиждень спостерігається зростання вмісту холестерину у крові піддослідних тварин і надалі таке зростання продовжується щонайменше 4 місяці (Цинциадзе и соавт., 1981). Це призводить до гістологічних та морфологічних змін тканин органів, зокрема: печінки, легенів, нирок, серця, стінок судин та інших. Виходячи з вищезазначеного, у даній роботі аналізували вплив введення у складі комплексів з ПЕІ трансгена АРОА1 людини на вміст тотального холестерину у плазмі крові, морфологію тканин печінки, серця та стінки аорти у кролів з експериментально індукованим атерослерозом.

Досліди проводили на кролях, які були поділенні на дві групи: тваринам першої групи (n=4) тричі вводили плазміду pTRhCMV-IEapo, дотримуючись проміжку один місяць між інєкціями; другій, контрольній, групі (n=4) вводили плазміду pTR, що не містить цільовий ген за такою ж схемою. Після першого введення плазмідної ДНК всіх кролів утримували на холестериновій дієті. На шосту добу після кожного введення препарату плазмідної ДНК у тварин відбирали кров для аналізу наявності АРОА1 людини. Одночасно визначали концентрацію тотального холестерину у плазмі крові тварин.

Для імунохімічного визначення вмісту АРОА1 людини у плазмі крові піддослідних кролів досліджували специфічність комерційних моноклональних та поліклональних антитіл проти АРОА1 людини та оптимізували метод Вестерн-блот аналізу.

З використанням методу Вестерн-блот аналізу на шосту добу після першої інєкції препарату ДНК/ПЕІ в плазмі крові трьох тварин першої групи було виявлено АРОА1 людини, в той час, як у плазмі тварин контрольної групи він не визначався (рис. 6). Порівняння рівнів експресії трансгена показало, що концентрація АРОА1 людини в плазмі крові відрізнялась від тварини до тварини і становила від ~ 1,6 мкг/мл до ~ 20,2 мкг/мл.

Аналіз зростання рівня тотального холестерину у плазмі крові тварин виявив достовірні розбіжності між контрольною та піддослідною групами тварин (табл. 4, рис. 7).

Таблиця 4

Зростання рівня холестерину у кролів, яким вводили плазміди, %

Попередні результати морфологічного дослідження тканин кролів контрольної групи виявило потовщення інтими у ділянці дуги аорти, а у тканинах печінки ? інфільтрацію ліпідами різного ступеня в центральних та периферійних зонах органа. У той же час аналіз тканин кролів, яким водили плазміду pTRhCMV-IEapo, не виявив атеросклеротичних змін аорти та печінки тварин (рис. 8).

ВИСНОВКИ

У результаті виконання дисертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різних промоторів, у клітинах ссавців in vitro; вивчено тривалість збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo, що був введений інєкцією у паренхіму печінки тварин у складі комплексу плазміди pTRhCMV-IEapo з ПЕІ.

1. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів hCMV-ІA та CAG: pTRhCMV-IAapo, pTRCAGapo, які, здатні забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітинах ссавців.

2. У транзиторній системі експресії для трансфікованих плазмідами pTRhCMV-IEapo та pTRhCMV-IAapo клітин СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на рівні ~ 0,4 нг/мл і ~ 3 нг білка/мл середовища, відповідно.

3. На культурах стабільних трансформантів СНО-К1 підтверджено, що гібридні промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором hCMV-ІЕ.

4. Експериментально показано можливість підвищення рівня експресії трансгенів, які є повнорозмірними геномними варіантами, введенням до складу елементів регуляції транскрипції послідовності інтрону.

5. Продемонстровано, що трансген, введений в організм піддослідних тварин інєкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з розгалуженим поліетиленіміном, може потрапляти крім печінки до тканин інших органів, зокрема: легенів, серця, нирок, лімфовузлів та клітин стінки аорти.

6. Встановлено збереження трансгена у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб у разі введення цільової ДНК інєкцією у паренхіму печінки у комплексі з поліетиленіміном.

7. На 6-ту добу після трансфекції плазмідою pTRhCMV-IEapo показано накопичення АРОА1 людини на рівні 1,6-20 мкг/мл у плазмі крові кролів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Вивчення транзиторної експресії гена АРОА1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в клітинах СНО-К1 // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 3. - С. 210-217. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантних плазмід; визначення рівня синтезу АРОА1 людини клітинами СНО-К1, трансфікованими препаратами ДНК/ПЕІ; ПЛР аналіз трансгена.

2. Гільчук Ю. М., Іродов Д. М., Старокадомський П. Л., Пішель І. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Розповсюдження по органам та експресія гена АРОА1 людини у складі введеної плазмідної ДНК in vivo // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 6. - С. 439 - 445. Особистий внесок здобувача - оптимізація умов проведення ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин кролів та свиней; виділення РНК із зразків печінки кролів; ПЛР аналіз ДНК тканин піддослідних тварин; тестування специфічності звязування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини у плазмі крові різних тварин методом Вестерн-блот аналізу; детекція АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

3. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Експресія гена аполіпопротеїна А-1 людини під контролем різних регуляторних послідовностей стабільними трансформантами СНО-К1 // Доповіді академії наук України. - 2007. - Т. 23, № 4. - С. 169-172. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантних плазмід; дослідження методами ELISA та Вестерн-блот аналізу культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ; проведення ПЛР аналізу ДНК тварин.

4. Гільчук Ю. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Вплив введення трансгена аполіпопротеїну А-1 людини на рівень холестерину та морфологію тканин у кролів, які утримувалися на холестериновій дієті // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 1. - С. 78-81.Особистий внесок здобувача - приготування препарату плазмідна ДНК/ПЕІ.

5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. - Aachen (Germany), 2003. - P. 664. Особистий внесок здобувача - тестування специфічності звязування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот аналізу; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

6. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PhD students and young scientists, Abstract book. - Kiyv (Ukraine), 2003. - P. 168. Особистий внесок здобувача - визначення методом ELISA рівня синтезу АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1.