Вікові особливості вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мозку щурів з гіпотиреозом і вплив на них інтенсивного фізичного навантаження

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗіНА

ХАДДАД АЙХАМ АЛІ

УДК: 616.441 - 008.64:612.66

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ Вільнорадикального ОКИСЛЕННЯ БІЛКІВ І ЛІПІДІВ У МОЗКУ Щурів З ГІПОТИРЕОЗОМ І ВПЛИВ НА НИХ ІНТЕНСИВНОГО ФІЗИЧНОГО НАВАНТАЖЕННЯ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти Міністерства охорони здоровя України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Давидов Вадим Вячеславович, Харківська медична академія післядипломної освіти Міністерства охорони здоровя України, професор кафедри клінічної біохімії і судово-медичної токсикології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Бабенко Наталія Олексіївна, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, НДІ біології, завідувач відділу фізіології онтогенезу доктор біологічних наук, професор. Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Захист відбудеться 18.06.2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий 17.05. 2008 року

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У цей час серед населення різних країн світу й, у тому числі України, має місце підвищення рівня захворюваності гіпотиреозом (Караченцев Ю.И. і співавт., 2002, 2004; Caparevic Z. et al., 2003; Караченцева И.Н., 2006; Monzani F. et al., 2006). Особливу небезпеку гіпотиреоз становить у ранньому дитячому й підлітковому віці. Це повязане з високим ризиком появи в дітей і підлітків глибоких порушень із боку центральної нервової системи, а також виникненням серйозних ускладнень у більш зрілому віці, у випадку несвоєчасної діагностики даного захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е., 2000). Серед різноманітних проявів гіпотиреозу широке поширення має ураження ЦНС, що проявляється у виникненні невротичних розладів (Larsen P.R., 1996; Зефирова Г.С., 1999). Механізм їхнього виникнення при гіпотиреозі дотепер не вивчений. Разом з тим, поява центральних порушень припускає модуляцію інтегративної функції мозку в організмі й, тим самим, сприяє порушенню функціонування інших внутрішніх органів і систем органів, що у свою чергу, визначає велику клінічну симптоматику даного захворювання (Зефирова Г.С., 1999; Браверман Л.Е., 2000).

Відповідно до сучасних уявлень, у ролі неспецифічної ланки розвитку численних фізіологічних станів і патологічних процесів виступає оксидативний стрес (Mazzetti I. et al., 2001; Cooper C.E. et al., 2002; Ofran H. et al., 2004; Nayanatara A.K. et al., 2005; Dmitriev L.F., 2007; Lovel M.A. et al., 2007; Pittagula M. et al., 2006; Flora S.J., 2007). Разом з тим, відомості про стан вільнорадикальних процесів у головному мозку при гіпотиреозі відрізняються суперечливістю (Venditti P. et al., 1997; Gredilla R. et al., 2001; Varghese S. et al., 2001; Brzezinska-Slebodzinska E., 2005). Усе вище викладене визначає високу актуальність дослідження вільнорадикальних процесів у мозку при гіпотиреозі. Всебічне вивчення цього питання відкриває перспективи в пізнанні механізмів розвитку даного захворювання, а також розробці нових підходів до його лікування й профілактики.

Беручи до уваги сучасні уявлення про фізіологічну роль оксидативного стресу і його участі у формуванні адаптивних реакцій в організмі (Vendemiale G. et al., 1999; Schoneich C. et al., 2006), великий інтерес становить також і зясування ефекту прооксидантних факторів на стан вільнорадикальних процесів у мозку при гіпотиреозі. Подібні фактори проявляються в організмі в умовах впливу на нього стресорів різної природи, і, у тому числі, при інтенсивному фізичному навантаженні (ІФН) (Leeuwenburgh C. et al., 2001; Sureda A. et al., 2005; Pittagula M. et al., 2006). Зміна ефекту прооксидантних факторів на стан вільнорадикальних процесів у клітинах, сприяє модуляції їхньої стійкості до несприятливих

зовнішніх впливів. У цьому звязку, новим перспективним напрямком у зясуванні причин формування невротичних розладів при гіпотиреозі, є вивчення за його наявності особливостей реалізації прооксидантної дії ІФН на мозок.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках держбюджетної теми “Вивчити вікові особливості метаболічної адаптації до дії ушкоджуючих факторів окисного стресу“ (N державної реєстрації 0102U002283).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення вікових особливостей формування оксидативного стресу в великих півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом і зясування впливу на них інтенсивного фізичного навантаження.

Для реалізації поставленої мети були визначені наступні завдання:

У мітохондріальній, мікросомальній і постмітохондріальній фракції великих півкуль головного мозку в дорослих статевозрілих (12-ти місячних) щурів і тварин пубертатного віку (1,5-місячних) з експериментальним гіпотиреозом після ІФН і без нього:

Визначити особливості накопичення продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків;

Оцінити ефективність функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту;

Вивчити швидкість індукованого перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) й вільнорадикального окислення білків.

Обєкт дослідження - вільнорадикальні процеси й ферменти першої лінії антиоксидантного захисту в мозку при експериментальному гіпотиреозі в щурів різного віку в нормі й при інтенсивному фізичному навантаженні.

Предмет дослідження - рівень накопичення продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів, швидкість індукованого вільнорадикального окислення білків і ліпідів, активність ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в субклітинних фракціях великих півкуль головного мозку.

Методи дослідження - спектрофотометрія у видимій і ближній ультрафіолетовій зоні спектра (визначення активності ферментів і вмісту продуктів вільнорадикального окислення); спектрофлюорометрія (вимір концентрації основ Шиффа); диференціальне центрифугування (фракціонування гомогенатів півкуль головного мозку), імуноферментний аналіз (визначення вмісту гормонів щитовидної залози й тиреотропного гормону в крові), статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів визначається тим, що в дисертаційній роботі вперше встановлені вікові особливості використання ліпідів і білків субклітинних фракцій великих півкуль головного мозку в процесах вільнорадикального окислення, а також зміни у цих процесах у щурів з експериментальним гіпотиреозом, що піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню й без нього. Показано, що в мозку дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку при гіпотиреозі формується стан оксидативного стресу. Це зрушення має неспецифічний характер і в більшій мірі проявляється в дорослих щурів.

Важливу роль у виникненні оксидативного стресу в мозку щурів з гіпотиреозом відіграє підвищення інтенсивності процесів радикалоутворення в мітохондріях. Воно не повязане зі зміною стану в них ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту. Більше того, характер зрушень із боку активності каталази й супероксиддисмутази (СОД), що виникають у дорослих щурів при експериментальному гіпотиреозі, припускає формування умов для підвищення ефективності функціонування першої лінії антиоксидантного захисту й, тим самим, обмежують ефект посиленого радикалоутворення в мітохондріях при оксидативному стресі.

Особливе значення у виникненні оксидативного стресу в мозку дорослих щурів при гіпотиреозі, здобуває підвищення чутливості мембран мікросом до дії прооксидантів. Подібне зрушення не характерне для тварин пубертатного віку, тому що ліпіди й білки досліджених субклітинних фракцій мозку в них проявляють підвищену стійкість до вільнорадикального окислення, навіть в умовах додаткового прооксидантного впливу ІФН.

Виявлено, що в дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку з експериментальним гіпотиреозом обмежений прояв прооксидантної дії на мозок інтенсивного фізичного навантаження. В основі формування цього зрушення лежить компенсаторне підвищення ефективності функціонування систем антиоксидантного захисту в мітохондріях мозку в умовах недостатності щитовидної залози. Виникнення оксидативного стресу в мозку й обмеження ефективності впливу на нього прооксидантних факторів, визначають появу функціональних порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати розширюють сучасну уяву про особливості вільнорадикального окислення ліпідів і білків субклітинних фракцій мозку в умовах впливу на організм несприятливих зовнішніх факторів. Вони розкривають механізми виникнення порушень із боку ЦНС при гіпотиреозі й указують на існування вікових особливостей їхньої появи в періоді статевого дозрівання. Результати проведених досліджень створюють теоретичні передумови для розробки нових підходів до лікування й профілактики порушень із боку ЦНС при захворюваннях, повязаних з недостатністю щитовидної залози, спрямованих на нормалізацію в ній стану вільнорадикальних процесів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під керівництвом доктора медичних наук, професора В.В. Давидова, з яким автор має загальні публікації. Результати, представлені в рукопису, отримані автором самостійно. Дисертантом особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка й аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи повідомлені на міжнародній науковій конференції студентів і молодих учених “Актуальні питання в сучасній медицині” (Харків, 2007); конференції молодих учених, присвяченої памяті професора В.П. Вендета “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2007” (Київ, 2007); міжнародної науково-практичної конференції ”Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества“ (Курск, 2007); на 5-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск, 2007); на науково-практичній конференції ”Внесок молодих учених у розвиток медичної науки й практики” (Харків, 2007); на ІІ Міжнародній конференції молодих учених “Биология: От молекулы до биосферы” (Харьков, 2007 г.); на науково-практичній конференції молодих учених: “Медична наука: сучасні досягнення й інновації” (Харків, 2007); на науково-практичній конференції з міжнародною участю: “Ендокринна патологія у віковому аспекті ” (Харків, 2007).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в 11 наукових публікаціях - 4 статтях у журналах, рекомендованих ВАК України й 7 - у збірках тез доповідей конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Робота викладена на 189 сторінках машинописного тексту й складається із вступу, огляду літератури, методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків і списку цитованої літератури, що включає 280 найменувань. Робота ілюстрована 16 таблицями й 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури містить аналіз сучасного стану питання про молекулярні механізми формування оксидативного стресу і його значення в адаптації організму до несприятливих зовнішніх впливів і розвитку патологічних процесів. Особлива увага приділяється розгляду даних літератури про особливості перебігу вільнорадикальних процесів у тканинах внутрішніх органів при гіпотиреозі й інтенсивному фізичному навантаженню.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження виконане на 144 щурах-самцях лінії Вістар, які втримувалися в умовах віварію Харківської медичної академії післядипломної освіти й забезпечувалися стандартним раціоном харчування. Тварин ділили на дві вікові групи: дорослі статевозрілі - 10 - 12 місяців (маса 240 - 360 г) і молоді, що перебувають у періоді статевого дозрівання - 1,5 місяця (маса 80- 90 г). Кожну групу ділили на чотири підгрупи: 1 - інтактні, 2 - щури, які піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню (плаванню до “відмови”), 3 - тварини, у яких відтворювався експериментальний гіпотиреоз, 4 - щури з експериментальним гіпотиреозом, яких піддавали інтенсивному фізичному навантаженню.

Для відтворення експериментального гіпотиреозу тваринам внутрішньоочеревинно вводився антитиреоїдний препарат мерказоліл з розрахунку 1 мг препарату на 100 г маси тварини. Препарат розчинявся в ізотонічному розчині хлористого натрію. Введення проводилося щодня протягом 15 днів (Krasilnikova O.A. et al., 2002).

Ефективність відтворення експериментального гіпотиреозу контролювалася шляхом визначення в крові концентрації тиреоїдних гормонів (тироксину, трийодотироніну) і тиреотропіну. Дослідження проводилися з використанням наборів для імуноферментних досліджень фірми “DAI” (США) на імуноферментному аналізаторі “HUMAREADER” (Німеччина).

З метою відтворення моделі інтенсивного фізичного навантаження щури піддавалися плаванню до “відмови” у круглих пластикових ємностях діаметром 40 см. Через годину після плавання тварини піддавалися евтаназії, відповідно до умов евтаназії, зазначених в методичних рекомендаціях МОЗ України та загальних етичних принципів проведення експериментів на тваринах, узгоджених з положеннями “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей”.

З півкуль головного мозку за допомогою скляного гомогенізатора Поттера-Ельвегейма готувалися 10 % гомогенати на 0,32 М сахарозі (рН 7,4). Отримані гомогенати піддавалися фракціонуванню за допомогою методу диференціального центрифугування з метою одержання мітохондріальної, мікросомальної і постмітохондріальної фракцій.

У субклітинних фракціях півкуль головного мозку проводилося визначення концентрації карбонільованих білків і продуктів вільнорадикального окислення ліпідів (основ Шиффа і дієнових конюгатів). Вимір вмісту карбонільованих білків (КБ) проводився за методом Дубиніної Є.Є. (2000). У розрахунках використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,1 ^. 10⁴ М^{-1 .} см^-1. Визначення основ Шиффа (ШО) проводилося за допомогою флюорометричного методу (Rice-Evans C.A. et al., 1991). В основу виміру концентрації дієнових конюгатів (ДК) був покладений спектрофотометричний метод Стальної І.Д. (1977). При розрахунках змісту дієнових конюгатів використовувався коефіцієнт молярної екстинкції, що відповідає 2,2 ^. 10⁵ М^{-1 .} см^-1. .

У мітохондріальній і мікросомальній фракції півкуль головного мозку досліджувалася швидкість індукованого ПОЛ та індукованого вільнорадикального окислення білків. Для цього 0,1 мл досліджуваної проби субклітинної фракції змішували з 1,5 мл 0,015 М фосфатного буфера (рН 7,4). Після трихвилинної преінкубації при 37 °С, у реакційну суміш вносили 0,2 мл 0,01 М солі Мора й 0,2 мл 1 М перекису водню. Проби інтенсивно перемішували й інкубували протягом 10 хвилин при 37 °С. Після цього реакція зупинялася за допомогою додавання трихлоруксусної кислоти до кінцевої концентрації 5 %. Проби центрифугували 15 хвилин при 3000 об/хв. В отриманому в такий спосіб осаді вимірювали вміст карбонільованих білків (Дубиніна Є.Є., 2000), а в супернатанті - ТБК-реактивних речовин. Визначення концентрації ТБК-реактивних речовин проводилося по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. У розрахунках використовували коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдегіду, що відповідає 1,53 ^. 10⁵ М^{-1 .} см^-1 (Esterbauer H. et al., 1990).

Для оцінки стану першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріальній і постмітохондріальній фракціях півкуль головного мозку вимірялася активність каталази (Барабой В.А. й ін., 1991) і супероксиддисмутази (Костюк В.А., 1990).

Вимір вмісту білка в аналізованих пробах визначали за Lowry O. et al. (1955).

Отримані результати піддавалися статистичній обробці з використанням непараметричного методу Wilcoxon-Mann-Whitney. Розходження між даними вважалися достовірними при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ та ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені дослідження показали, що в мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу. Його проявом служить накопичення в них у мітохондріальній і мікросомальній фракції великих півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків (табл. 1 і 2).

Підвищення інтенсивності вільнорадикального окислення ліпідів у мікросомальній фракції мозку в щурів з гіпотиреозом супроводжується збільшенням у ній вмісту дієнових конюгатів, при відсутності накопичення основ Шиффа. При цьому виникає підвищення індексу співвідношення ДК/ШО в мікросомах мозку щурів обох вікових груп, порівняно з його вихідною величиною (рис. 1).

Таблиця 1

Вміст продуктів ПОЛ у субклітинних фракціях великих півкуль головного мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Виникнення подібного зрушення в співвідношенні початкових і кінцевих продуктів ПОЛ, може бути повязане зі зміною переважних шляхів метаболізму проміжних продуктів вільнорадикального окислення ліпідів, до числа яких можна віднести численні карбонільні сполуки й, у тому числі, ендогенні альдегіди. В умовах стимуляції перекісного окислення ліпідів у мікросомах це зрушення здобуває адаптивного значення, спрямованого на обмеження ушкоджуючої дії оксидативного стресу (Davydov V.V. et al., 2004).

Таблиця 2

Вміст карбонільованих білків (нмоль/мг білка) у субклітинних фракціях мозку інтактних щурів і тварин з експериментальним гіпотиреозом (M + m; n = 5 - 6)

Примітки: 1) КБ₃₆₃ - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 363 нм; КБ₃₇₀ - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм;

2) * - Р< 0,05 порівняно з інтактними; ** - Р< 0,05 порівняно з інтактними 1,5-місячними.

Рис. 1. Величина співвідношення ДК/ШО в мікросомальній фракції півкуль головного мозку 1,5- (світлі стовпчики) і 12-ти місячних - (темні стовпчики) щурів з експериментальним гіпотиреозом. Примітка. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними.

Отримані дані про виникнення оксидативного стресу в півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом відповідають відомостям інших авторів (Das K. et al., 2004). Разом з тим, у цьому дослідженні вперше встановлений факт існування характерних вікових рис у прояві оксидативного стресу в мозку при досліджуваній патології. Основним їхнім проявом є більша виразність оксидативного стресу при гіпотиреозі в мозку в дорослих статевозрілих тварин, ніж у щурів у періоді статевого дозрівання. Підтвердженням цього є дані про неоднаковий рівень накопичення в щурів у субклітинних фракціях півкуль головного мозку продуктів вільнорадикального окислення. В мітохондріях мозку в дорослих щурів з гіпотиреозом відбувається збільшення концентрації ДК, ШО й карбонільованих білків на 133, 55 і 91 % відповідно, у порівнянні з їхнім вихідним рівнем (табл. 1). У той же час у тварин пубертатного віку відбувається тільки підвищення концентрації карбонільованих білків на 76 % порівняно з інтактними щурами цієї вікової групи (табл. 2). Причому, у мітохондріях мозку дорослих тварин і щурів пубертатного віку накопичуються різні фракції карбонільованих білків: в 12-ти місячних - карбонільовані білки, фенілгідразони яких мають максимум світлопоглинання при 370 нм (КБ₃₇₀) , а в 1,5-місячних - при 363 нм відповідно (КБ₃₆₃). Виникаюче зрушення обумовлює появу в них різноспрямованих змін з боку індексу співвідношення КБ₃₆₃/КБ₃₇₀ у мітохондріальній фракції мозку.

На відміну від мітохондріальної, у мікросомальній фракції мозку щурів обох вікових груп при гіпотиреозі виникають односпрямовані зміни вмісту продуктів вільнорадикального окислення, які проявляються в підвищенні вмісту в ній дієнових конюгатів. Разом з тим, в 12-ти місячних тварин вміст ДК зростає на 244 %, а в 1,5-місячних - тільки на 61 %, у порівнянні з їхньою вихідною величиною. При цьому в щурів пубертатного віку при гіпотиреозі виявляється в 3,5 рази менше за значенням, ніж у дорослих тварин, підвищення рівня співвідношення початкових і кінцевих продуктів ПОЛ (ДК/ШО) у мікросомальній фракції. Таким чином, у півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу, більшою мірою виражений в дорослих тварин, ніж у щурів пубертатного віку. Оскільки оксидативний стрес виникає внаслідок дисбалансу між станом процесів радикалоутворення й ефективністю антиоксидантного захисту (Betteridge D.J., 2000; Montuschi Р. et al., 2007), з метою зясування причин його появи, у субклітинних фракціях півкуль головного мозку в щурів з гіпотиреозом було проведене вивчення стану антиоксидантного захисту. Дослідження показали, що в мітохондріальній фракції мозку 12-ти місячних щурів з гіпотиреозом відбувається двохкратне підвищення активності каталази, у порівнянні з її вихідним рівнем. Одночасно в них виявляється виражена тенденція до підвищення активності СОД. При цьому величина індексу співвідношення активності каталаза/СОД, в 12-ти місячних щурів з гіпотиреозом залишається на вихідному рівні. В 1,5-місячних тварин з експериментальним гіпотиреозом активність каталази в мітохондріальній фракції мозку відповідає його величині в інтактних щурів. У постмітохондріальній фракції мозку у тварин обох досліджених вікових груп активність каталази не змінюється й відповідає її вихідній величині (Р > 0,05). Однак в 1,5-місячних щурів при цьому виявляється виражена тенденція до її підвищення, що обумовлює в них зростання індексу співвідношення каталаза/СОД на 122 % у порівнянні з інтактними щурами даної вікової групи. Беручи до уваги, сучасні уявлення про тісну функціональну взаємодію ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в клітині (Мурадян Ф.Х. та ін., 2003; Baud О. et al., 2004), можна припустити, що в подібній ситуації в щурів пубертатного віку при гіпотиреозі виникають передумови для зниження ефективності функціонування першої лінії антиоксидантного захисту в цитозолі нервових клітин.

Результати проведених досліджень указують на те, що в дорослих статевозрілих щурів при експериментальному гіпотиреозі формуються передумови для підвищення ефективності функціонування першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріях і, тим самим, обмеження в них ушкоджуючих ефектів посиленого радикалоутворення при оксидативному стресі. У тварин пубертатного віку при гіпотиреозі виникають умови для порушення функціонування даної ферментативної системи в цитозолі нервових клітин. Однак, незважаючи на це, у них не відбувається посилення проявів оксидативного стресу в мозку. Більше того, в 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом подібного зрушення не виникає навіть після додаткового впливу інтенсивного фізичного навантаження. Причиною того може бути зниження ролі СОД і каталази в захисті нервових клітин від вільнорадикального ушкодження в пубертатному віці. Цілком ймовірно, на цьому етапі онтогенезу в захисті мозку від оксидативного стресу зростає значення інших антиоксидантів, до числа яких, цілком ймовірно, включають глютатіон. Отримані результати дають підстави для висновку про те, що виникнення оксидативного стресу в мозку щурів при експериментальному гіпотиреозі не повязане зі зміною стану ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту в нервових клітинах. З огляду на це, можна припустити існування причинно-наслідкових відносин між його появою й посиленням процесів радикалоутворення в нервових клітинах, у звязку з підвищенням їхньої чутливості до дії прооксидантів. Для перевірки цього припущення було проведене дослідження чутливості субклітинних фракцій мозку щурів з гіпотиреозом до дії прооксидантів.

Проведені дослідження показали, що в субклітинних фракціях мозку 1,5-місячних і 12-місячних тварин значно розрізняється базальний рівень індукованого ПОЛ й вільнорадикального окислення білків (рис. 2). При цьому швидкість індукованих вільнорадикальних процесів у щурів пубертатного віку вище, ніж у статевозрілих. Існування подібних вікових зрушень визначає виникнення вік-залежних особливостей у їхній модуляції при гіпотиреозі. У дорослих тварин з експериментальним гіпотиреозом, на тлі підтримки вихідного рівня індукованого вільнорадикального окислення білків у мітохондріальній і постмітохондріальній фракції мозку, виникає істотне гальмування швидкості накопичення КБ₃₇₀ у мікросомальній фракції. У той же час у мікросомальній фракції мозку в них підвищується швидкість індукованого ПОЛ на 146 %, у порівнянні з вихідною величиною (рис. 3). У щурів пубертатного віку в мітохондріальній і мікросомальній фракції мозку при гіпотиреозі зменшується швидкість індукованого вільнорадикального окислення білків і ліпідів.

Рис. 2. Швидкість індукованого ПОЛ (у нмоль ТБК-реактивних речовин / хв ^. мг білка) і індукованого накопичення карбонільованих білків (у нмоль КБ/ хв ^. мг білка) у мітохондріальній (А) і мікросомальній (Б) фракції півкуль головного мозку інтактних щурів різного віку. Примітки: 1) і-КБ₃₆₃ та і-КБ₃₇₀ - швидкість накопичення карбонільованих білків, максимум поглинання фенілгідразонів яких становить 363 або 370 нм відповідно; 2) * - Р< 0,05 порівняно з інтактними.

Отримані дані вказують на те, що певне значення у виникненні оксидативного стресу в мозку дорослих щурів при гіпотиреозі може відігравати підвищення чутливості мікросом до дії прооксидантів. Це не характерно для тварин пубертатного віку, у яких ліпіди й білки досліджених субклітинних фракцій мозку проявляють високу стійкість до вільнорадикального окислення, навіть в умовах додаткового прооксидантного впливу при ІФН.

Таким чином, виникнення оксидативного стресу в мозку щурів при гіпотиреозі може бути повязане з посиленням процесів радикалоутворення в мітохондріях нервових клітин. Механізм стимуляції радикалоутворення в мітохондріях мозку не звязаний ні з підвищенням чутливості цих внутрішньоклітинних структур до дії прооксидантів, ні з порушенням ефективності функціонування в них ферментативної системи першої лінії антиоксидантного захисту. Певну роль у її виникненні, цілком ймовірно, здобуває зниження вмісту в мітохондріях низькомолекулярних антиоксидантів або зміна в них стану процесів, сполучених із транспортом електронів по дихальному ланцюгу, внаслідок стресу, який виникає в організмі при гіпотиреозі. Підвищення інтенсивності вільнорадикальних процесів у мітохондріях сприяє їхньому посиленню й у мікросомах мозку. Наслідком цього стає стимуляція в них ПОЛ.

Рис. 3. Швидкість індукованого ПОЛ (у нмоль ТБК-реактивних речовин / хв ^. мг білка) у мітохондріальній (МТ) і мікросомальній (МС) фракції півкуль головного мозку 1,5-місячних (А) і 12-ти місячних (Б) щурів. Примітка. * - Р< 0,05 порівняно з інтактними.

У дорослих статевозрілих щурів прояв оксидативного стресу в мозку при гіпотиреозі виражені в більшій мірі, ніж у тварин пубертатного віку. Однієї із причин цього може бути зниження чутливості мітохондрій і мікросом до дії прооксидантних факторів, що, крім іншого, повязане зі збільшенням вмісту в них базальної концентрації продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків.

Поява вікових особливостей у прояві оксидативного стресу в мозку при гіпотиреозі визначає модуляцію його відповіді на зовнішні прооксидантні впливи, що має для мозку серйозні наслідки. Подібне припущення засноване на сучасних уявленнях про фізіологічну роль активних форм кисню (АФК) і активних форм азоту (АФА) і їхній участі у формуванні адаптивних реакцій (Lecour S. et al., 2005; Park H.S. et al., 2006; Calabrese V. et al., 2007; Valko M. et al., 2007).

З огляду на це, було проведене вивчення процесів вільнорадикального окислення ліпідів і білків в 1,5-місячних і 12-ти місячних щурів з гіпотиреозом після додаткового впливу на них ІФН. Прооксидантні ефекти фізичного навантаження встановлені численними дослідженнями різних авторів (Leeuwenburgh C. et al., 2001; Cooper C.E. et al., 2002; Ofran H. et al., 2004; Sureda A. et al., 2005; Pittagula M. et al., 2006). Цим дослідженням повною мірою відповідають і результати наших експериментів, повязаних з вивченням впливу ІФН на вільнорадикальне окислення ліпідів і білків у субклітинних фракціях головного мозку щурів обох використаних вікових груп.

Проведені дослідження показали, що вміст продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і білків у мітохондріях мозку 12-ти і 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом, підданих ІФН, наближається до такого в інтактних тварин. Виникненню подібного зрушення сприяє ціла низка факторів. Насамперед, цьому сприяє збільшення вмісту продуктів вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мітохондріях мозку при гіпотиреозі. Крім цього, у дорослих щурів з гіпотиреозом, формуються умови для підвищення ефективності функціонування ферментів першої лінії антиоксидантного захисту, а у тварин пубертатного віку, судячи зі швидкості індукованого накопичення КБ₃₆₃, обмежується чутливість білків субклітинних фракцій мозку до вільнорадикального окислення.

На відміну від мітохондріальної фракції, у мікросомах мозку в щурів з гіпотиреозом після ІНФ підтримується підвищена концентрація дієнових конюгатів, що відповідає її величині у тварин контрольної групи (гіпотиреоз). У щурів пубертатного віку появі подібного зрушення сприяє збільшення чутливості ліпідів і білків мікросом до вільнорадикального окислення, а також зрушення в активності ферментів першої лінії антиоксидантного захисту в цитозолі нервових клітин.

Беручи до уваги роль мітохондрій у процесі радикалоутворення в нервових клітинах і з огляду на характер отриманих у роботі даних, можна дійти висновку про те, що в мозку щурів з гіпотиреозом при інтенсивному фізичному навантаженні відбувається обмеження проявів оксидативного стресу. В основі формування цього феномена, цілком ймовірно, лежить компенсаторне підвищення потужності систем його антиоксидантного захисту в мітохондріях мозку, за рахунок якого наступні впливи прооксидантних факторів і, у тому числі ІФН, не викликають подальшого посилення проявів оксидативного стресу.

Обмеження ефекту прооксидантних факторів на мозок сприяє модуляції реакції центральної нервової системи на зовнішні впливи й, тим самим, визначає порушення її функціонування при гіпотиреозі. Виникнення подібного зрушення має місце у тварин обох досліджених вікових груп. Однак, характер прояву вікових особливостей у формуванні оксидативного стресу в мозку при гіпотиреозі дозволяє припускати збільшення центральних порушень при даній патології в періоді статевого дозрівання.

ВИСНОВКИ

У півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом виникає стан оксидативного стресу, що проявляється накопиченням у їх мітохондріальній, мікросомальній і постмітохондріальній фракції продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і карбонільованих білків.

Прояв оксидативного стресу при експериментальному гіпотиреозі в півкулях головного мозку дорослих статевозрілих ( 12-ти місячних) щурів виражений у більшій мірі, ніж у тварин у періоді статевого дозрівання (1,5-місячних).

У мітохондріальній фракції мозку 12-ти місячних щурів з експериментальним гіпотиреозом виникають зрушення в активності каталази й СОД, які сприяють підвищенню в них ефективності функціонування першої лінії антиоксидантного захисту в мітохондріях. Активність цих ензимів у постмітохондріальній фракції мозку в цих тварин не змінюється. В 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом у постмітохондріальній фракції мозку зявляються зрушення в активності досліджених ферментів у першій лінії антиоксидантного захисту, які призводять до порушення ефективності його функціонування в цитозолі нервових клітин. Активність СОД і каталази в мітохондріальній фракції мозку підтримується в них на вихідному рівні.

Ліпіди й білки субклітинних фракцій головного мозку 1,5-місячних щурів з гіпотиреозом проявляють підвищену стійкість до вільнорадикального окислення. В 12-ти місячних тварин з гіпотиреозом підтримується на вихідному рівні швидкість індукованого вільнорадикального окислення ліпідів і білків у мітохондріальній фракції мозку, але зростає швидкість індукованого ПОЛ в його мікросомальній фракції.

У дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку при експериментальному гіпотиреозі обмежується прояв прооксидантної дії інтенсивного фізичного навантаження на головний мозок. Причиною виникнення цього феномена є компенсаторне підвищення потужності систем антиоксидантного захисту мітохондрій мозку при гіпотиреозі.

СПИСОК праць, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМою ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Возрастные особенности изменения процессов свободнорадикального окисления в мозгу крыс с гипотиреозом // Український біохімічний журнал. - 2007. - Т. 79, N 6. - С. 74 - 80. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням експериментальних моделей на тваринах, фракціонуванням півкуль головного мозку, визначенням концентрації продуктів ПОЛ й карбонільованих білків, виміром активності антиоксидантних ферментів і швидкості індукованих вільнорадикальних процесів, проведена статистична обробка отриманих даних).

2. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Возрастные особенности проявления оксидативного стресса в митохондриях мозга крыс, подвергнутых интенсивной физической нагрузке // Експериментальна i клiнiчна медицина. - 2007. - N 3. - С. 27 - 30. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням моделі інтенсивного фізичного навантаження, фракціонуванням півкуль головного мозку, визначенням концентрації продуктів ПОЛ й карбонільованих білків, виміром активності антиоксидантних ферментів і швидкості індукованих вільнорадикальних процесів, проведена статистична обробка отриманих даних).

3. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Возрастные особенности свободнорадикального окисления липидов и белков в мозге крыс с экспериментальным гипотиреозом // Проблеми ендокринної патологiї. - 2007. - N 3.- С. 62 - 68. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням експериментального гіпотиреозу, фракціонуванням півкуль головного мозку, визначенням концентрації продуктів ПОЛ й карбонільованих білків, виміром активності антиоксидантних ферментів і швидкості індукованих вільнорадикальних процесів, проведена статистична обробка отриманих даних).

4. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Особенности формирования оксидативного стресса у крыс разного возраста с тиреоидной недостаточностью // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Серия Биология. - 2007. - Т. 788, N 6. - С. 164 - 169. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням експериментальних моделей на тваринах, фракціонуванням півкуль головного мозку, визначенням концентрації продуктів ПОЛ й карбонільованих білків, виміром активності антиоксидантних ферментів і швидкості індукованих вільнорадикальних процесів, проведена статистична обробка отриманих даних).

5. Хаддад Айхам Али. Влияние физической нагрузки на свободнорадикальные процессы в митохондриях мозга крыс разного возраста // Материалы международной научно-практической конференции “Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических, технико-экономических сфер жизни общества” (Курск, 26-27 марта 2007г.). - Курск, 2007. - С. 436 - 437.

Хаддад Айхам Али. Свободнорадикальное окисление липидов и белков в мозге крыс с экспериментальным гипотиреозом // Матеріали міжнародної наукової конференції студентів і молодих учених “Актуальні питання в сучасній медицині” (Харків, 26-28 березня 2007 р.). - Харків, 2007. - С. 146.

7. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Возрастные особенности изменения активности ферментов первой линии антиоксидантной защиты в субклеточных фракциях полушарий головного мозга крыс с гипотиреозом // Материалы 5-й национальной научно-практической конференции с международным участием “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск, 18-22 сентября 2007 г.). - Смоленск: СНТИ, 2007. - С. 248 - 250. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням експериментальних моделей на тваринах, фракціонуванням півкуль головного мозку, виміром активності антиоксидантних ферментів і проведена статистична обробка отриманих даних).

8. Хаддад Айхам Али, Давыдов В.В. Возрастные особенности изменения продукции тиреоидных гормонов и ТТГ при экспериментальном гипотиреозе // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю “Ендокринна патологія у віковому аспекті” (Харків, 29-30 листопада 2007 р.). - Харьков, 2007. - С. 94 - 95. (Дисертантом проведена експериментальна частина досліджень, повязана з відтворенням експериментальних моделей на тваринах, виміром концентрації тиреоїдних гормонів у крові і проведена статистична обробка отриманих даних).

9. Хаддад Айхам Али. Скорость индуцированного свободнорадикального окисления белков в субклеточных фракциях полушарий головного мозга крыс разного возраста с экспериментальным гипотиреозом // Матеріали науково-практичної конференції ”Внесок молодих учених у розвиток медичної науки й практики” (Харків, 13 листопада 2007 г.). - Харків, 2007. - С. 110 - 111.

10. Хаддад Айхам Али. Возрастные особенности изменения содержания карбонилированных белков в митохондриальной фракции мозга крыс с гипотиреозом // Матеріали ІІ Міжнародної конференції молодих учених “Биология: От молекулы до биосферы” (Харьков, 19 - 21 ноября 2007 г.). - Харьков, 2007. - С. 76 - 77.

11. Хаддад Айхам Алі. Вікові особливості зміни вільнорадикальних процесів у субклітинних фракціях мозку щурів з гіпотиреозом, що піддавалися інтенсивному фізичному навантаженню // Матеріали науково-практичної конференції молодих учених “Медична наука: сучасні досягнення й інновації” (Харків, 22 листопада 2007 г.). - Харків, 2007. - С. 71.

АНОТАЦІЯ

Хаддад Айхам Алі. “Вікові особливості вільнорадикального окислення білків і ліпідів у мозку щурів з гіпотиреозом і вплив на них інтенсивного фізичного навантаження”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню вікових особливостей виникнення оксидативного стресу в півкулях головного мозку щурів при експериментальному гіпотиреозі.

Проведені дослідження показали, що в півкулях головного мозку щурів з експериментальним гіпотиреозом, виникає стан оксидативного стресу, що проявляється накопиченням у його мітохондріальній, мікросомальній і постмітохондріальній фракції продуктів вільнорадикального окислення ліпідів і карбонільованих білків. Формування оксидативного стресу обумовлено підвищенням інтенсивності процесів радикалоутворення в мітохондріях нервових клітин. Його прояв при гіпотиреозі в більшій мірі виражений в 12-ти місячних, ніж в 1,5-місячних тварин. Формування експериментального гіпотиреозу в дорослих статевозрілих щурів і тварин пубертатного віку приводить до обмеження проявів прооксидантної дії інтенсивного фізичного навантаження на головний мозок. Причиною виникнення цього зрушення є компенсаторне підвищення ефективності функціонування систем антиоксидантного захисту мітохондрій мозку при гіпотиреозі.

Ключові слова: головний мозок, гіпотиреоз, оксидативний стрес, перекісне окислення ліпідів, вільнорадикальне окислення білків, інтенсивне фізичне навантаження, пубертат.

АННОТАЦИЯ

Хаддад Айхам Али. “Возрастные особенности свободнорадикального окисления белков и липидов в мозге крыс с гипотиреозом и влияние на них интенсивной физической нагрузки”. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению возрастных особенностей возникновения оксидативного стресса в полушариях головного мозга крыс при экспериментальном гипотиреозе.

В исследованиях использовали 1,5- и 12-ти месячных крыс, которых делили на 4 группы: 1 - интактные, 2 - крысы, подвергнутые интенсивной физической нагрузке (плаванью “до отказа”), 3 - животные с экспериментальным гипотиреозом, который воспроизводился путем двухнедельного внутрибрюшинного введения мерказолила, 4 - крысы с экспериментальным гипотиреозом, подвергнутые интенсивной физической нагрузке. Эффективность воспроизведения экспериментального гипотиреоза оценивалась по уровню тиреотропного гормона, трийодтиронина и тироксина в крови. В субклеточных фракциях полушарий головного мозга исследованных крыс проводилось определение концентрации карбонилированных белков и продуктов перекисного окисления липидов, а также скорости индуцированного прооксидантами свободнорадикального окисления белков и липидов. В митохондриальной и постмитохондриальной фракции измерялась активность ферментов первой линии антиоксидантной защиты - каталазы и супероксид-дисмутазы.

Проведенные исследования показали, что в полушариях головного мозга крыс с экспериментальным гипотиреозом возникает состояние оксидативного стресса, которое проявляется накоплением в их митохондриальной и микросомальной фракции продуктов свободнорадикального окисления липидов и карбонилированных белков. Формирование оксидативного стресса обусловлено усилением интенсивности процессов радикалообразования в митохондриях нервных клеток. Проявление оксидативного стресса в мозге крыс с экспериментальным гипотиреозом в большей мере выражено в 12-ти месячном, чем в 1,5-месячном возрасте. Формирование особенностей в проявлении оксидативного стресса в мозге взрослых крыс и животных, находящихся в периоде полового созревания, связано с возрастными различиями в функционировании митохондриальной и цитозольной систем антиоксидантной защиты нервных клеток.

Установлено, что в митохондриальной фракции мозга у 12-ти месячных крыс с экспериментальным гипотиреозом возникают изменения в активности каталазы и СОД, которые способствуют повышению эффективности функционирования первой линии антиоксидантной защиты в митохондриях. При этом активность данных энзимов в постмитохондриальной фракции мозга у них не изменяется. У 1,5-месячных крыс с гипотиреозом в постмитохондриальной фракции мозга появляются сдвиги в активности исследованных ферментов в первой линии антиоксидантной защиты, которые предрасполагают к нарушению эффективности ее функционирования в цитозоле нервных клеток. В то же время, активность СОД и каталазы в митохондриальной фракции мозга поддерживается у них на исходно м уровне.

Результаты изучения скорости индуцированных свободнорадикальных процессов показали, что липиды и белки субклеточных фракций головного мозга 1,5-месячных крыс с гипотиреозом проявляют повышенную устойчивость к свободнорадикальному окислению. У 12-ти месячных животных с гипотиреозом поддерживается на исходном уровне скорость индуцированного свободнорадикального окисления липидов и белков в митохондриальной фракции мозга, но возрастает скорость индуцированного ПОЛ в микросомальной фракции.

Обнаружено, что в митохондриальной и микросомальной фракции полушарий головного мозга 12-ти месячных и 1,5-месячных крыс, подвергнутых интенсивной физической нагрузке, происходит накопление продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков. При экспериментальном гипотиреозе у животных обеих исследованных возрастных групп происходит ограничение проявлений прооксидантного действия интенсивной физической нагрузки на головной мозг. Причиной формирования этого сдвига является компенсаторное повышение эффективности функционирования систем антиоксидантной защиты митохондрий мозга при гипотиреозе.

Возникновение оксидативного стресса в мозге и ограничение эффективности воздействия на него прооксидантных факторов, способствуют появлению функциональных нарушений со стороны ЦНС при гипотиреозе.

Ключевые слова: головной мозг, гипотиреоз, оксидативный стресс, перекисное окисление липидов, свободнорадикальное окисление белков, интенсивная физическая нагрузка, пубертат.

SUMMARY

Haddad Ayham Ali. “Age peculiarities of lipid and protein free radical oxidation in the brain of rats with hypothyroidism and effect of exercises to them”. - Manuscript.

Thesis for a degree of candidate of science in biology on speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kharkiv V.N. Karazin National University, Kharkiv. -2008.

Age peculiarities of oxidative stress formation in the rats brain with experimental hypothyroidism were investigated.

The results obtained show that hypothyroidism is accompanied by oxidative stress formation in the rats brain. It is manifested by an increase in concentration of lipid peroxidation products and protein carbonyls in mitochondrial and microsomal subcellular fractions of the brain. An increase in free radical generation in mitochondria during hypothyroidism plays a pivotal role in oxidative stress formation. The value of oxidative stress manifestation is greater in the brain of 12-months-old rats with hypothyroidism than in 1, 5-5- months-old ones. Hypothyroidism in adult and pubertal rats promotes to a decrease in prooxidant effects exercise on the brain. It may be due to an increase in antioxidant defense in brain mitochondria in hypothyroidism.

Key words: brain, hypothyroidism, oxidative stress, lipid peroxidation, protein free radical oxidation, exercises, pubertal.

ПЕРЕЛІК СКОРОЧЕНЬ

АФА - активні форми азоту

АФК - активні форми кисню

ДК - дієнові конюгати

ІФН - інтенсивне фізичне навантаження

КБ - карбонільовані білки

ПОЛ - перекисне окислення ліпідів

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК- реактивні речовини - речовини, що дають позитивну реакцію з 2-тіобарбітуровою кислотою

ШО - основи Шиффа