32
Дипломная работа
«Исследование токсикологических характеристик новых высокомолекулярных флокулянтов»
Содержание
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1 Особенности использования методов биотестирования и биоиндикации для мониторинга состояния окружающей среды
1.2 Контроль качества природных и сточных вод на биоиндикаторе Daphnia magna Strauss
1.3 Динамика смертности и продолжительность жизни лабораторной
культуры D. magna
1.4 Чувствительность Daphnia magna Strauss к химическим препаратам
1.4.. Чувствительность к бихромату калия
1.4.2 Чувствительность к хрому
1.4.3 Чувствительность к меди
1.4.4 Чувствительность к дибутилфталату
1.4.5 Чувствительность к имазалил-сульфату
1.5 Лазерная автодинная интеферометрия динамических параметров биообъектов Daphnia magna Strauss
1.6 Выживаемость и поведенческая активность Daphnia magna как критерий качества р. Протвы в районе г. Обнинска
1.7 Экспериментальное биотестирование качества воды реки Днепр
1.8 Оценка качества реки Волга методом биотестирования
1.9 Оценка токсичности сточных вод завода по переработке
1. 10 Изучение токсичности стоков Марийского целлюлозно-бумажного комбината на Daphnia magna Strauss
Глава II. Экспериментальная часть
2.1 Подготовка исходных реагентов
2.2 Синтез мономерной соли на основе метакриловой и акриловой кислоты и гуанидина
2.3 Синтез сополимеров
2.4 Биологические тест-объекты и показатели, используемые при установлении эколого- токсикологических нормативов
2.5 Методики биотестирования
2.6 Общая методика определения токсичности воды на дафниях
2.8 Методика биотестирования на хирономидах Chironomus dorsalis
2.9 Методика биотестирования на комарах обыкновенных Culex sp
2.10 Методика битестирования на водных жесткокрылых: Platambus maculatus, Haliplus flavicolis и Gyrinus sp
Глава III. Обсуждение результатов
Выводы
Литература
Введение
Большинство способов очистки природных и производственных сточных вод, а также способов уплотнения и обезвоживания осадков различного типа основано на применении реагентов. В последние годы в качестве реагентов все большее распространение приобретают водорастворимые высокомолекулярные вещества - флокулянты. Их использование позволяет улучшить качество очистки, повысить производительность очистных сооружений, а некоторые технологические методы, например центрифугирование, вообще невозможно осуществить без применения флокулянтов.
Одним из важных показателей для применения реагента в качестве флокулянта являются его токсикологические характеристики, так как для очистки воды могут применяться полимеры, не действующие на человека, животных, фауну и флору водоемов.
Для проведения токсикологической оценки и контроля качества воды имеется множество приборов как отечественного, так и зарубежного производства. Перспективным методом оценки эколого-токсикологических характеристик воды, прошедшей обработку реагентами является биологический метод оценки состояния водоема, который позволяет решить задачи, разрешение которых с помощью гидрофизических и гидрохимических методов невозможно. Оценка степени загрязнения водоема по составу живых организмов позволяет быстро установить его санитарное состояние, определить степень и характер загрязнения и пути его распространения в водоеме, а также дать количественную характеристику протекания процессов естественного самоочищения.
Среди особых преимуществ биологических методов следует отметить то, что они чувствительны к большому спектру химических веществ и позволяют фиксировать негативные изменения в природной среде при низких концентрациях загрязнителей.
Изучение эколого-токсикологических характеристик новых реагентов, применяемых в процессах водоочистки, позволит разработать как оптимальные технологии их получения, так и определить предельно-допустимые концентрации этих веществ в воде.
Учитывая сказанное, мы полагаем, что исследование токсикологических характеристик новых реагентов для очистки воды и выявление чувствительных тест-объектов для этих целей является весьма актуальной задачей.
Цели настоящей работы заключались в выявлении новых индикаторов для биотестирования и исследовании ранее неизученных токсикологических характеристик гуанидинсодержащих сополимеров акриламида.
Глава I. Обзор литературы
1.1 Особенности использования методов биотестирования и биоиндикации для мониторинга состояния окружающей среды
Биотестирование - использование в контролируемых условиях биологических объектов (тест-объектов) для выявления и оценки действия факторов (в том числе и токсических) окружающей среды на организм, его отдельную функцию или систему организмов. Хорошие результаты дает анализ бентосных (придонных) беспозвоночных. Оценка чистоты водоемов делается по преобладанию, либо отсутствию тех или иных таксонов.
В зависимости от скорости проявления биоиндикаторных реакций выделяют несколько различных типов чувствительности тест-организмов:
· I тип - биоиндикатор проявляет внезапную и сильную реакцию, продолжающуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнитель.
· II тип - биоиндикатор в течении длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнителя.
· III тип - после немедленной, сильной реакции у биоиндикатора наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное.
· IV тип - под влиянием загрязнителя реакция биоиндикатора постепенно становится все более интенсивной, однако, достигнув максимума постепенно затухает.
· V тип - реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция биоиндикаторных параметров.
Требования к биоиндикаторам
1. накопление загрязняющих веществ не должно приводить к гибели тест-организмов;
2. численность тест-организмов должна быть достаточной для отбора, т.е. без влияния на их воспроизводство;
3. в случае долгосрочных наблюдений предпочтительны многолетние виды флоры;
4. фитотесты должны быть генетически однородными;
5. должна быть обеспечена легкость взятия проб;
6. должна реализоваться относительная быстрота проведения тестирования;
7. биотесты должны обеспечивать получение достаточно точных и воспроизводимых результатов;
8. биоиндикаторы должны быть одновозрастными и характеризоваться, по-возможности, близкими свойствами;
9. диапазон погрешностей измерений (по сравнению с классическими или эталонными методами тестирования) не должен превышать 20-30%;
10. при выборе тест-организмов предпочтение следует отдавать регистрации функциональных, этологических, цитогенетических изменений отдельных индикаторных процессов биоты, а не только изменению ее структуры, численности или биомассы, т.к. эти последние являются более консервативными [1-3].
Биотестирование и биоиндикация являются основными элементами биологического мониторинга состояния окружающей среды. Возможен мониторинг, как состояния биологических объектов, так и компонентов окружающей среды. Оценка проб среды с использованием тест-организмов и наблюдение за состоянием биообъектов, вносимых в контролируемую экосистему в разнообразных садках, представляет собой биотестирование (схема 1). Биотестирование выполняет функцию тактического контроля происходящего загрязнения, нацеленного на получение быстрого сигнала о токсичности и необходимой степени разбавления конкретных стоков. На водном объекте оно может быть эффективным с момента начала загрязнения до его завершения. Биоиндикация выявляет результат произошедшего вредоносного воздействия на окружающую среду. Может применяться на экологическом объекте постоянно, но эффективность его станет очевидной при начале неблагоприятных экологических изменений. Эти три элемента общей природоохранной стратегии дополняют, но не способны заменить друг друга. Задачей экологов является отработка оптимальных режимов применения каждого из подходов, целенаправленного и обоснованного применения их в системе ограничения загрязнения.
Условия, определяемые с помощью организмов-биоиндикаторов, называются объектами биоиндикации. Ими могут быть как определенные типы природных объектов (почва, воздух, вода), так и различные свойства этих объектов (механический, химический состав и др.) и определенные процессы, протекающие в окружающей среде (эрозия, заболачивание и т.п.), в том числе происходящие под влиянием человека. Среди особых преимуществ биологических методов следует отметить то, что они позволяют фиксировать негативные изменения в природной среде при низких концентрациях загрязняющих веществ.
Использование биоиндикаторов позволяет:
· обнаруживать места скоплений в экологических системах различного рода загрязнений;
· проследить динамику изменений в окружающей среде;
· определить степень вредности тех или иных веществ для живой природы, в частности для человека;
· составить прогноз дальнейшего развития экосистемы.
Биоиндикацию можно проводить на видовом и биоценотическом уровне. Видовой уровень включает в себя констатацию присутствия организма, учет частоты его встречаемости, изучение его анатомо-морфологических особенностей, физиологии, биохимии. При биоценотическом уровне исследования учитываются различные показатели разнообразия видов, продуктивность данного сообщества.
Существуют различные виды биоиндикации. Если одна и та же реакция вызывается различными факторами, то говорят о неспецифической биоиндикации. Если же те или иные происходящие изменения можно связать только с одним фактором, то речь идет о специфической биоиндикации. Например, лишайники и хвойные деревья могут характеризовать чистоту воздуха и наличие промышленных загрязнений в местах их произрастания. Видовой состав животных и низших растений, обитающих в почвах, является специфическим для различных почвенных комплексов, поэтому изменения этих группировок и численность видов в них могут свидетельствовать о загрязнении почв химическими веществами.
Методы биоиндикации подразделяются на два вида: регистрирующая и аккумулятивная биоиндикация. Регистрирующая биоиндикация позволяет оценивать воздействие факторов среды по состоянию особей вида или популяции, а биоиндикация по аккумуляции использует свойство живых организмов накапливать некоторые химические вещества. В соответствии с этими методами различают и типы биоиндикаторов.
Регистрирующие биоиндикаторы реагируют на изменение внешней среды изменением численности, фенооблика, изменением скорости роста, соматическими проявлениями (в том числе уродливостью) и другими хорошо заметными признаками. Примером таких биоиндикаторов служат лишайники и хвоя деревьев (хлороз, некроз) и их суховершинность.
Накапливающие биоиндикаторы концентрируют загрязняющие вещества в своих тканях, определенных органах и частях тела, которые в последующем используются для выяснения степени загрязнения окружающей среды при помощи химического анализа. В качестве примера можно назвать хитиновые панцири ракообразных и личинок насекомых, обитающих в воде, мхи, печень млекопитающих. Аккумулятивную биоиндикацию используют при исследовании процессов миграции токсичных веществ.
Методы регистрирующей биоиндикации наиболее доступны для использования в условиях экспедиции или экологического лагеря, так как они не требуют применения сложных приборов и трудоемких методик. Ниже приведены примеры использования различных биоиндикаторов при оценке экологического состояние водных объектов [4-7].
32
1.2 Контроль качества природных и сточных вод на биоиндикаторе Daphnia magna Strauss.
Биотестирование наряду с биоиндикацией является обязательным элементом современной системы контроля качества вод. Подробную современную формулировку биотестирования дают А. А. Зенин и Н. Б. Белоусова: «Биотестирование - один из приемов определения степени токсического действия неблагоприятных факторов среды, потенциально опасных для живых организмов экосистем, в контролируемых экспериментальных лабораторных или натурных условиях путем регистрации изменений биологически значимых показателей исследуемых водных объектов с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности» [8].
Во второй половине XX столетия в связи с необходимостью оценки токсичности природных и сточных вод, а также некоторых химических веществ во многих странах мира стали использовать биотестирование на Daphnia magna Straus. Впервые D. magna как индикатор токсичности воды была предложена в 1929г. [9]. В СССР начало подобных исследований связано с работами Н.С.Строганова и его школы, Е.А.Веселова и Л.А.Лесникова [10]. Позже последователями американской школы биотестирования была предложена Ceriodaphnia affinis Lilljeborg, и этот вид, наряду с D. magna и D. pulex (De Geеr, 1778), был введен в руководства по биотестированию во многих странах мира. В последнее время дафний рекомендовано использовать и для биотестирования питьевых вод [11]. Поэтому необходимо как можно более полное знание биологии вида, выбранного в качестве тест-объекта, в условиях его использования в виде лабораторной культуры.
Ветвистоусые рачки дафнии (рис.1) обычно имеют длину не более 2--3 мм, характеризуются двумя парами усиков-антенн, ясно выраженной головой с большим сложным глазом, состоящим из двух десятков простых глазков, четырьмя парами ножек и мешковидным выростом с яйцами на спине. Антенны небольшие, но сильно развиты, двуветвистые и служат для плавания. Голова дафний спереди вытянута в остренький «клюв», тело покрыто прозрачной двустворчатой раковинкой из тонкого хитина, брюшные ножки скрыты под раковинкой, на грудных ножках находятся жаберные лепестки. У дафний даже есть сердце. Сердце дафний, сокращаясь несколько десятков раз в минуту, проталкивает кровь вначале к голове, а затем к жабрам и заднему концу тела. Окраска, в зависимости от питания, колеблется от розово-желтой до красной при дефиците кислорода. Питаются дафнии мелкими водорослями и бактериями. В течение лета рачки размножаются партеногенетически, нося неоплодотворенные яйца на спине, в так называемой выводковой камере. Самцы у дафний редки, появляются обычно к осени и всегда значительно мельче самок.
Рис. 1. Daphnia magna Strauss
Исследована изменчивость биологических параметров лабораторной культуры D. magna в оптимальных условиях длительного лабораторного культивирования.
1.3 Динамика смертности и продолжительность жизни лабораторной культуры D. magna.
Смертность определялась в процентах от общего количества фертильных или неполовозрелых самок на каждый месяц. Под неполовозрелыми подразумевались все самки, не успевшие дать потомство (рис. 2)
Рис. 2. Динамика смертности в лабораторной культуре D. magna при оптимальных условиях лабораторного культивирования, в % от общего числа подопытных животных за месяц: 1 - фертильных самок, 2 - неполовозрелых самок
Как видно из рисунка 2, кривая смертности фертильных самок имеет 3 максимума и 3 минимума, причем максимумы, начиная с январского, уменьшаются в соответствии с определенной закономерностью: каждый последующий отличается от предыдущего приблизительно в 1, 3 раза.
Кривая смертности неполовозрелых самок (рис. 2) имеет по два максимума и минимума, причем январский максимум (45, 6%) совпадает с январским максимумом смертности фертильных самок и соответствует также самой большой смертности за месяц на протяжении всего года. Апрельский пик смертности невелик и равен величине данного параметра за декабрь (11, 1%). Минимальная смертность неполовозрелых самок наблюдается в феврале-марте и на протяжении длительного периода - с мая по октябрь включительно.
Продолжительность жизни D. magna. Продолжительность жизни отдельных особей D. magna определялась довольно точно в связи с индивидуальным культивированием и использованием для закладки каждой повторности только 1-2суточных рачков.
Нижний и верхний пределы продолжительности жизни D. magna составили соответственно несколько часов (в пределах суток) и 7, 57 месяца, причем в среднем дольше всех прожили рачки, родившиеся в январе (4, 18 месяца - без учета смертности неполовозрелых самок, 3, 14 месяца - с учетом месяца). Особенно велика продолжительность жизни рачков, родившихся в последней декаде января - 5, 64 и 4, 63 месяца [5, 6].
Результаты индивидуальной продолжительности жизни культуры D. magna при оптимальных условиях культивирования представлены в секторальной диаграмме (рис. 3). Единицей измерения в данном случае выбран отрезок в 1 месяц, так как в природе дафнии живут в среднем 20-25 суток, т. е. приблизительно месяц [11]. Дафнии, прожившие меньше 15 суток, в диаграмме не учтены. Из диаграммы видно, что количество особей, проживших от 1 до 7 месяцев, колеблется от 7, 9 до 21, 1%.
Рис. 3. Соотношение особей D. magna с различной продолжительностью жизни. Количество особей (от общего числа проживших): 1-7 - месяцы.
Максимальная продолжительность жизни D. magna в оптимальных условиях лабораторного культивирования в опыте равна 7 месяцам (и более), причем доля проживших максимальный срок составляет более половины от числа особей, проживших около месяца [13].
При увеличении продолжительности жизни реальная плодовитость D. magna увеличивается [14].
Для изучения продолжительности жизни, роста и сроков созревания ракообразных в лабораторных условиях ежедневно проводили наблюдения за их выживаемостью и продолжительностью жизни, приростом, сроками появления яиц в выводковых камерах самок, количеством молоди в первом и последующих поколениях. Размеры молоди и взрослых самок измеряли на микроскопе МБС-9 при помощи окуляр-микрометра [12, 15, 16].
В работе 17 введение в культуру S. vetulus, M. macrocopa, C. affinis, S. mucronata и D. magna было проведено по общей схеме. Одну партеногенетическую самку помещали в стакан с контрольной аквариумной водой, туда же ежедневно вносили корм: суспензию сухих пекарских дрожжей и смесь культур зеленых водорослей Chlorella vulgaris Beijer и Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. После получения потомства взрослых самок отсаживали, а молодь помещали в аквариумы объемом 1л для создания генетически однородной монокультуры, происходящей от одной партеногенетической самки [23].
1.4 Чувствительность Daphnia magna Strauss к химическим препаратам
1.4.1 Чувствительность к бихромату калия.
Использован стандартный токсикант бихромат калия, который продолжительное время сохраняет первоначально внесенную концентрацию, стабилен в растворах и относится к классу сильнотоксичных веществ[22]. Для эксперимента из исходного раствора (1 г/л) была приготовлена серия разведений от 1 до 10 мг/л.
В специальные планшеты с объемом камеры 10 мл в контроль и соответствующие концентрации токсиканта были помещены ювенисы, по одному в камеру. Эксперимент выполнялся в 10 повторностях. В первый час экспозиции наблюдения за животными велись непрерывно, с 2 до 12ч - ежечасно, далее - через 24ч экспозиции. Фиксировали нарушения фототаксиса, характера движения, остановки движения, отсутствие реакции на прикосновение и гибель. Наблюдения за животными в течение первых часов экспозиции позволили установить пороговые концентрации, вызывающие изменения в поведении и характере движения ракообразных, а также близкие к ним LC0 или NOEC (no observed effect concentration) - концентрации, не вызывающие токсического эффекта [23].
Введение в культуру считается состоявшимся в случае, если от одной партеногенетической самки удается получить устойчиво развивающуюся лабораторную популяцию [18,19]. В лабораторных условиях в культуре с невысокой плотностью посадки ракообразных, при постоянной температуре, освещенности, полноценном питании, ациклическая (без появления самцов в популяции) смена поколений партеногенетических самок может продолжаться длительное время [22]. Важным условием длительного ациклического культивирования партеногенетического поколения ветвистоусых ракообразных является создание оптимальных температурных и световых условий, режима кормления и рациона. У каждого из пяти поддерживаемых в культурах видов численность молоди в первом поколении всегда было ниже, чем в последующих[21] (см. рис 4.).
Рисунок 4. Изменения средней плодовитости партеногенетических самок ветвистоусых ракообразных в течение репродуктивного возраста в условиях лабораторного культивирования
По [22], число яиц у D. magna в летние месяцы может достигать 42 экз., при 15 выметах в течение жизни.
Достигается высокая плодовитость этого вида (более 1000 потомков) за счет полноценного рациона и при значительных объемах сосудов-культиваторов. В наших экспериментах таких высоких значений плодовитости добиться не удалось, по-видимому, из-за недостаточного объема культиватора и неполного рациона. Проведение в будущем исследований по изучению сезонной динамики плодовитости ракообразных в культуре позволит выяснить оптимальные световые и температурные условия культивирования введенных в культуру дафниид и прогнозировать вероятные возможности прироста лабораторных популяций в различные сезоны года.
Для получения данных о сравнительной чувствительности объектов культивирования была выполнена серия экспериментов по выживаемости организмов в растворах бихромата калия [20].
Таблица 1.
Токсикометрические показатели влияния бихромата калия на ювенисы (I) и овариальных самок (II) ветвистоусых ракообразных
|
Тест-объект |
Возраст микро-популяции, мес |
Пороговая кон-ция, мг/л |
LC0-24, мг/л |
|||
|
I |
II |
I |
II |
|||
|
Daphnia magna |
6 |
2,0 |
3,0 |
1,0 |
3,0 |
|
|
Ceriodaphnia affinis |
>60 |
2,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
|
Simocephalus vetulus |
12 |
2,0 |
4,0 |
2,0 |
3,0 |
|
|
Moina macrocopa |
2 |
1,0 |
2,0 |
1,0 |
1,0 |
|
|
Scapholeberis mucronata |
12 |
2,0 |
3,0 |
2,0 |
2,0 |
|
Наиболее чувствительной к действию бихромата калия была M. macrocopa, наименее - D. magna. Взрослые овариальные самки исследованных видов ракообразных по показателю LC50-24 менее чувствительны к стандартному токсиканту бихромату калия, чем суточные ювенисы.
По показателям выживаемости и плодовитости (количества молодых особей, живых и мертвых) планктонных ракообразных D. magna было оценено влияние образцов донных грунтов на токсичность различных веществ в водной среде [24].
Выявлена избирательность в накоплении загрязняющих веществ донными грунтами, отражающаяся в изменении токсичности этих веществ для дафний. Для проведения исследований по токсическому воздействию вредных веществ на ракообразных были выбраны следующие вещества: бихромат калия гидратированный хлорид меди, фунгицид имазил сульфата, дибутилфталат. Оценивали действие растворов каждого вещества в 2-3 концентрациях в присутствии 4-х видов грунтов.
Регулярно учитывали выживаемость рачков, количество и выживаемость молоди. Для половозрелых особей показателем гибели служило полное прекращение движения, а показателем гибели эмбрионов выброс мертвых зародышей из выводковой камеры самок. Параллельно оценивали состояние кишечника, окраску его содержимого, окраску тела рачков [24].
1.4.2 Чувствительность к хрому
В отсутствие грунтов все концентрации хрома для рачков D. magna были абсолютно-летальными. Так, при концентрации 0,3 мгСг/л без грунта гибель рачков завершалась в среднем к 14,5 суткам, при более высокой концентрации гибель 100% рачков происходила еще быстрее (в среднем, к 6,5 суткам). Однако в присутствие песчанистого ила гибель рачков при концентрации 0,3 мгСг/л была несущественной. При концентрациях 0,5 и 0,7 мгСг/л в присутствие песчанистого ила все рачки жили в течение 7 суток, однако затем выживаемость резко снижалась. В присутствии песка и илистого песка токсичность хрома менялась мало. Причем, при увеличении концентрации хрома, защитный эффект песка снижался. Эффект детрита и песчанистого ила на токсичность был более выраженным, и с увеличением концентрации повышался. Влияние грунтов на токсичность хрома проявлялось и по эффекту на плодовитость рачков. Сами грунты на плодовитость практически не влияли. При действии бихромата калия в концентрации 0,5 и 0,7 мг Сг/л без грунтов молодые особи вплоть до окончания опыта вообще не рождались. В концентрации 0,3 мг Сг/л были отмечены единичные молодые особи. В присутствии грунтов, за исключением песка и илистого песка, размножение происходило даже активнее, чем в опытах без грунта, однако по мере увеличения концентрации токсиканта число молодых особей снижалось [25].
1.4.3 Чувствительность к меди
В отсутствие грунтов все концентрации меди также были абсолютно-летальными. При концентрации 0,05 мг Си/л без грунта рачки погибали, в среднем, к 15 суткам, при концентрации 0,1 мг Си/л - к 4,75 суткам. Все исследованные грунты, за исключением песка, существенно снижали токсичность меди для рачков. Наибольший защитный эффект был выявлен для илистого песка, песчанистого ила и детрита. В присутствие детрита гибели рачков к окончанию эксперимента не отмечено при концентрации 0,05 мг Сu/л, а при концентрации 0,1 мг Си/л выживаемость рачков к концу опыта составляла 95%.
При концентрации меди 0,05 мл/л в присутствии песка большое количество дафний погибло уже к 15-тым суткам, а при концентрации 0,1м г/л 100%-ная гибель рачков происходила к уже 5-ым суткам (табл. 2). Это свидетельствует о том, что песок обладает слабой сорбционной способностью по отношению к ионам меди и чем выше концентрация меди в растворе, тем быстрее наступает насыщение.
Влияние грунтов на токсичность меди проявлялось также и по эффекту на плодовитость рачков D. magna. Наличие грунтов в контроле на плодовитость влияло незначительно, несколько стимулировал размножение только детрит. Присутствие хлорида меди в растворе приводило к тому. что молодых рачков вообще не было в концентрации 0,1 мг Сu/л, а в концентрации 0,05 мг Сu/л рождаемость была незначительной, причем отмечены были и мертвые эмбрионы. В концентрации 0,05 мг Си /л при наличии песка размножение было подавленным, при наличии детрита и песчанистого ила плодовитость оказалась даже выше, чем в контроле с этими же видами грунтов. При концентрации 0,1 мг Сu/л в присутствии песка размножения вообще не происходило, а песчанистый ил и детрит стимулировали рождаемость молодых рачков [26].
1.4.4 Чувствительность к дибутилфталату
Все концентрации дибутилфталата в отсутствие грунтов были абсолютно-летальными, за исключением концентрации 0,01 мг/л. При концентрации 0,03 мг/л без грунта гибель рачков завершалась, в среднем, к 4 суткам, при концентрации 0,05 мг/л, в среднем, - к 2,5 суткам. В присутствие песчанистого ила и илистого песка гибель рачков была несущественной. При концентрации 0,05 мг/л в присутствие песчанистого ила выживаемость рачков к концу эксперимента составляла более 60%, в присутствие илистого песка - более 80%. При увеличении концентрации дибутилфталата защитный эффект илистого песка и песчанистого ила существенно увеличивался. Это свидетельствует о том, что выбранных концентрациях меди не исчерпывается поглотительная способность грунтов. При одинаковых концентрациях дибутилфталата в растворе значения ОПВ в присутствии илистого песка и песчанистого ила были близкими. Детрит и песок менее активно связывают токсикант. Выживаемость рачков в растворе дибутилфталата в концентрации 0,05 мг/л в присутствии песка не отличалась от выживаемости без грунта. При действии дибутилфталата в концентрациях 0,03 и 0,05 мг/л без грунтов молодые особи вплоть до окончания опыта вообще не рождались.
1.4.5 Чувствительность к имазалил-сульфату
На токсичность имазалил-сульфата для рачков до концентрации 1 мг/л влиял только илистый песок (отмечено некоторое увеличение ОПВ при переходе концентрации от 0,5 мг/л к 1 мг/л). Защитное действие остальных грунтов практически не проявлялось (табл. 3.9). При более высокой концентрации имазалил-сульфата (2 мг/л) ОПВ в присутствие илистого песка составило 230%, а песчанистого ила и детрита - 140% и 160%, соответственно. Проявление относительно высокого защитного эффекта детрита и песчанистого ила при концентрации 2,0 мг/л может свидетельствовать о том, что для образования комплекса имазалила с компонентами донных грунтов необходимо достижение определенного концентрационного порога токсиканта, однако содержание органической составляющей не имело существенного значения. Имазалил-сульфат, в основном, вызывал гибель эмбрионов, в связи с чем, количество молодых рачков при концентрации 0,5 мг/л было низким, особенно в отсутствие грунта. При более высоких концентрациях в отсутствие и при наличии грунтов молодых рачков обнаружено не было.
В целом, от действия хрома в водной среде лучше всего защищал рачков детрит и песчанистый ил, от меди - песчанистый ил, детрит и илистый песок. От органических загрязнителей, таких как дибутилфталат, лучше всего защищал дафний песчанистый ил и илистый песок, от действия фунгицида имазалил сульфата в большей степени только илистый песок [27].
1.5 Лазерная автодинная интерферометрия динамических параметров биообъектов Daphnia magna Strauss
Для оценки степени загрязнения окружающей среды широкое применение могут найти методы, основанные на оценке физиологических параметров биологических тест-объектов. В качестве тест-объектов для контроля состояния водной среды используются пресноводные рачки дафнии (Daphnia magna Strauss). В работах [28, 29] показана сильная зависимость периода биений сердца дафнии от концентрации гидрохинона в водном растворе и установлено влияние концентрации фенола на частоту дыхания дафнии. Однако низкая чувствительность фотоэлектрических методов, используемых в отмеченных выше работах, и невозможность их использования при регистрации прошедшего через биообъект излучения не позволяли провести комплексные исследования изменения физиологических параметров тестируемых биообъектов.
С целью увеличения числа информативных параметров, характеризующих поведение дафний в токсичной среде, разработана методика, основанная на использовании эффекта автодинного детектирования в полупроводниковом лазере [30].
В основу метода регистрации динамического состояния тест - объектов положен принцип формирования сигнала внешнего автодетектирования при возвращении части отраженного от контролируемого объекта излучения в резонатор полупроводникового лазера [30, 31]. Для реализации метода использовалась установка (схема 2). Излучение полупроводникового лазера 7 (ИЛПН - 206), стабилизированного источником тока 8, фокусировалось линзой 6 в область сердца дафнии 4, помещенной в канал 3 на прозрачном столике 5. Для визуализации инфракрасного излучения полупроводникового лазера и его фокусировки в область сердца использовался прибор ночного видения 1. Часть излучения, отраженного от сердца дафнии, возвращалась в резонатор полупроводникового лазера, изменение выходной мощности которого регистрировалось фотодетектором 9. Сигнал с фотодетектора поступал через усилитель 10 и аналого-цифровой преобразователь 11 в компьютер 12. После вычисления спектра продетектированного сигнала с помощью метода быстрого преобразования Фурье определялся период колебаний сердца дафнии.
Схема 2. Экспериментальная установка для измерения частоты биений сердца дафнии
Частота сердцебиения дафний в контрольных условиях изменяется незначительно и стабилизируется после пятиминутной адаптации. Уменьшение частоты биений сердца дафнии регистрировалось для концентраций фенола, превышающих величину 1,2 тg/l. Наибольшее уменьшение частоты биений сердца дафнии наблюдалось для концентраций фенола 10 mg/l. При этом частота становилась равной 200 ударов в минуту в конце периода экспозиции.
Другими параметрами, которые могут быть зарегистрированы в схеме лазерной автодинной системы, являются амплитуда и форма про детектированного сигнала. Частота сердцебиения дафнии определялась по гармонике с максимальной амплитудой в заданном диапазоне изменений частоты вибраций биообъекта, а амплитуда колебаний - по набору спектральных гармоник. При наличии фенола в водной среде амплитуда биений сердца дафнии составила 0.2 мm, что существенно меньше амплитуды биений сердца дафнии в отсутствие фенола (0.4 мm) [31, 32].
1.6 Выживаемость и поведенческая активность Daphnia magna как критерий качества р. Протвы в районе г. Обнинска
Оценка качества воды в р. Протвы проводилась в рекреационной зоне г. Обнинска и санитарно-защитной зоне ФЭИ по выживаемости и поведенческой активности дафний [33]. В качестве показателей в остром опыте учитывались поведенческие реакции. Оценка этого показателя может проводиться по балльной системе. Контролем служили показатели выживаемости дафний, помещенных в дехлорированную отстоянную водопроводную воду по 10 штук в стаканчики на 100 мл. Если гибель контрольных дафний в период испытаний превысила 10%, то опыт повторялся заново [34]. Выживаемость и поведенческая активность дафний в исследуемой и контрольной воде в точках пробоотбора регистрировались через 15, 30, 45, 60 (1ч), 150, 1440 (1сут) минут.
По выживаемости и поведенческой активности дафний, по которым сделано заключение о классе качества воды р. Протвы.
Результаты показали, что сильно токсична вода в районе первого промканализационного сброса ФЭИ, а также в районе сброса городских сточных вод и плотины. Наблюдается тенденция к угнетению жизнедеятельности дафний за вторым промканализационным стоком ФЭИ. Пробы воды в районе промканализационных сбросов ФЭИ относятся ко второму классу загрязнённости воды, несмотря на то, что выживаемость дафний в этих точка 100%-ная, наблюдается угнетение активности, особи держатся в придонном слое, часть совсем теряет активность, наблюдаются случаи «вертячки». Не исключено, что загрязнение может вноситься в реку несанкционированными способами, например, объектом загрязнения на данном участки р. Протвы может оказаться д. Потресово, с ее выпасами скота, мытьем машин в реке, стиркой белья, сливом отработанной воды с огородов.
В районе первого сброса ГНЦ РФ ФЭИ, где идет строительство, хорошо коррелируют данные по выживаемости и поведению дафний (гибель 80%, случаи вертячки). Гибель дафний в пробах, отнесённых ко второму классу загрязнённости воды, не велика или практически отсутствует, зато повышение активности сменяется угнетением, дафнии периодически залегают на дно [35, 36].
1.7 Экспериментальное биотестирование качества воды реки Днепр
В работе [37] с использованием Daphnia magna Straus определена токсичность сточной воды сбрасываемой в р. Днепр водопользователями и воды самого водотока. Для опытов и использовали сточную воду, сбрасываемую в зимнее время с очистных сооружений г. Орши, Могилева, Речицы и речную воду с 9 створов, расположенных в районе выше указанных промышленных городов (выше городов - 5-12 км, ниже сброса с очистных сооружений - 0,5 км, ниже сброса с очистных сооружений - 4-5 км). Поставлено 14 хронических опытов с двукратной повторностью. Дня опытов использовали четырехдневную молодь дафний. Продолжительность опытов составляла 35 суток.
Определение степени токсичности воды р. Днепр и сточных вод, сбрасываемых водопользователями, проведенное в хронических опытах с дафниями и оцененное по 3-х бальной системе [38], показало токсичность сточной воды сбрасываемой г. Речица, где на 35 сутки отмечена 100% гибель рачков. Вредность воды для гидробионтов установлена и для сточной воды г. Могилева и створа 6, расположенного на расстоянии 4-5 км от сброса сточных вод. Выживаемость рачков на этих створах составила от 10 до 90% (табл. 2). На всех остальных створах, а также в сточной воде с очистных сооружений г. Орши, выживаемость рачков составила 100%, что согласно 3-х бальной системе оценки вода на этом участке чистая.
Таблица 2
Результаты биотестирования при определении хронического токсического действия воды р. Днепр на дафний
|
Створ, № |
Объем тестируемой воды, мл |
Исходное количество дафний, экз. |
Количество дафний в конце опыта |
% погибших |
Количество отродившейся молоди, экз |
|
|
1 |
300 |
5 |
5 |
0 |
535,5 |
|
|
Сточная вода |
300 |
5 |
5 |
0 |
454,5 |
|
|
2 |
300 |
5 |
5 |
0 |
475,0 |
|
|
3 |
300 |
5 |
5 |
0 |
527,5 |
|
|
4 |
300 |
5 |
5 |
0 |
532,5 |
|
|
Сточная вода |
300 |
5 |
4,5 |
10 |
686,5 |
|
|
5 |
300 |
5 |
5 |
0 |
662,5 |
|
|
6 |
300 |
5 |
4 |
20 |
499,5 |
|
|
7 |
300 |
5 |
5 |
0 |
489,5 |
|
|
Сточная вода |
300 |
5 |
0 |
100 |
563,0 |
|
|
8 |
300 |
5 |
5 |
0 |
515,0 |
|
|
9 |
300 |
5 |
5 |
0 |
547,0 |
|
Загрязнение воды не оказывало отрицательного действия на плодовитость рачков. Средняя плодовитость дафний на загрязненных створах была более высокой, чем на чистых. В среднем плодовитость дафний составила на относительно чистых створах р. Днепр 95,0-107,0 экз./особь, что загрязненных - 103,0-140,8 экз./особь, что позволяет говорить, как об устойчивости крупных ракообразных к длительному воздействию малых доз токсических веществ, так и об антропогенном эвтрофировании воли тока, приводящее к увеличению численности гидробионтов.
Под влиянием антропогенного воздействия усиливается эвтрофирование водотока, проявляющееся в накоплении в воде биогенов (азота и фосфора), что способствует усилению продуцирования гидробионтов в реке [39].
По данным областного комитета охраны природных ресурсов, в Белгородской области накопилось огромное количество забракованных и неиспользованных пестицидов и химических удобрений, которые в силу различных объективных причин утратили свою ценность для сельского хозяйства, таких, как «Берием» - 11800 кг, «ДДТ» - 3700 кг, «Зеопас» - 1940 кг; «Гексатиурам» - 5027 кг, бочки с неизвестными ядами - 11400 кг, неизвестные сыпучие пестициды - 37000 кг, и др.[40]. Для подтверждения гипотезы о возможности проникновения пестицидов из мини - контейнеров в окружающую водную среду было проведено биотестирование.
Методика эксперимента основана на определении изменений выживаемости тест - объектов - Daphnia Magna при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем. Кратковременное тестирование до 96 часов позволяет определить острое токсическое воздействие воды на дафний по их выживаемости.
В ходе эксперимента было установлено, что уже через 1 час с момента посадки дафний во всех пробах, кроме контрольной, наступила 100% гибель дафний. В контрольном растворе все дафнии были живы в течение всего эксперимента, т.е. 96 часов.
Полученные результаты подтвердили предположение о вероятности проникновения пестицидов через бетонный барьер. С учётом малой толщины стенки мини - контейнеров в производственных условиях при толщине стенок 0,2 м процессы проникновения токсикантов и биокоррозии строительных материалов растянутся на годы, но опасность загрязнения окружающей среды захороненными пестицидами имеет высокую долю вероятности [39].
1.8 Оценка качества реки Волга методом биотестирования
Методом биотестирования было исследовано место сброса недостаточно очищенных сточных вод первых очистных сооружений (ОС) г. Волжска, в прибрежной зоне р. Волги, где находятся участки как с замедленным водообменом, так и с высокой скоростью течения [41]. Были выбраны следующие точки отбора проб:
Рис. 5. Карта-схема района сброса сточных вод с городских сооружений г. Волжска.
В ходе эксперимента велась регистрация следующих показателей: выживаемость, плодовитость и физиологическое состояние дафний.
Выживаемость дафний в % в течение опыта.
|
Дата наблюдения |
18.окт |
20.окт |
22.окт |
24.окт |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Контроль |
< p align="left">100+0
Рис.6. Плодовитость дафний в исследуемых пробах воды.
Наибольшее количество органических и взвешенных веществ наблюдалось в пробе воды №4, где отмечалась самая высокая плодовитость дафний и самая низкая выживаемость. Всплеск рождаемости дафний в пробе № 4 объясняется тем, что повышенное содержание органических веществ стимулирует рождаемость дафний. В месте сброса сточных вод (проба №5) ВЭМЗа вода относится к мезосапробной зоне по определительной таблице Л.С. Лесникова, выживаемость дафний на конец опыта составила 77% [42, 43]. Исследования [44] выявили значительную роль микрофитов (Chlorella vulgaris), прижизненных выделений макрофитов (рогоза узколистного Typha latifolia), совокупности природного планктона в регуляции выживаемости, репродуктивных процессов, токсикорезистентности водных ракообразных Daphnia magna в условиях пиретроидного загрязнения. Наиболее высокое антитоксическое влияние на дафний проявили: сухое вещество хлореллы, совокупность живого природного планктона, полученная за счет его концентрирования с учетом средних значений объемов, процеживаемых дафниями за определенный промежуток времени, его сухого вещества, а также прижизненные выделения макрофитов (вода отбиралась из проточных зарослей). Коэффициенты выживаемости (КВ) на фоне дециса (1 мкг/л) достигали соответственно, 1.0, 0.79, 0.76, 0.59. В условиях традиционного биотестирования на отстоянной водопроводной воде на фоне дециса к концу эксперимента (15 суток) выживаемость дафний составляла 10% (КВ = 0.2). В более ранние (1 декада июня) и поздние (3 декада августа) сроки выявленная тенденция сохранялась, но была менее выражена, особенно в августе. 1.9 Оценка токсичности сточных вод завода по переработке семян подсолнечника
С помощью Daphnia Magna были проведены исследования качества сточных вод завода по переработке семян подсолнечника в г. Донецке на разных стадиях их очистки [45]. Результаты исследований приведены в табл. 3. Таблица 3 Исследования качества сточных вод на заводе по переработке семян подсолнечника в г. Донецке (2003 - 2005 гг.)
Сточные воды, прошедшие весь технологический процесс очистки, не выявляют отрицательного влияния на жизнеспособность тест-организмов даже в хроническом эксперименте (на протяжении месяца наблюдений). Таким образом, методы биотестирования можно использовать для определения качества очистки сточных вод после каждой стадии и достаточность очистки в целом. Кроме того, предложена новая методика, которая объединяет химический и биологический подходы. С помощью дафний выявляют в воде фосфорорганические пестициды. Пробу воды делят на две порции. В одной пестициды переводят в нетоксичную для дафний форму с помощью определенных реагентов. Вторая порция воды - контрольная. Если в контроле дафнии погибают, а в обработанной реагентами части пробы живут, то можно говорить о наличии в пробе токсичных веществ, причем именно фосфорорганических пестицидов (ведь в воде может быть и другой токсикант). Предел группового обнаружения пестицидов этим методом составляет 0,0006 мг/л, то есть на уровне ПДК (0,0005 мг/л для дихлофоса). Если же, как предлагают ученые, повысить температуру раствора с 20 до 35-36°С (критическая температура для жизни дафний), то их чувствительность к токсикантам повысится в десять раз, а время анализа сократится в 3-7 раз (в теплой воде дафнии погибнут раньше и от меньшей доли яда) [40]. Биотестирование на D. magna проводилось с целью комплексной оценки качества воды водоема-охладителя Березовской ГРЭС-I [46]. Пробы воды отбирали с поверхностного горизонта в контрольных точках, характерных для каждой части акватории водоема. Для определения острого токсического действия тестируемую воду не разбавляют. В сосуды наливают 15 мл контрольной, тестируемой воды, помещают туда по одной молодой дафнии, которых отлавливают пипеткой, переносят в сачке из планктонного газа. Учет выживших дафний проводят через 24 и 48 ч от начала биотестирования. В течение 48 ч дафний не кормят. Если в любой наблюдаемый период в тестируемой воде гибнет 50% и более тест-объектов, биотестирование прекращают. Пробы воды, отобранные в районах устьев рек Берешь и Базыр водоема-охладителя остро токсичны. В этой мелководной части акватории водоема в летний период интенсивно развиваются сине-зеленые водоросли, разложение биомассы которых является основным источником токсичности. В приплотинной части акватории водоема пробы воды также оказывают остро токсическое действие на тест-объекты. Это можно объяснить тем, что в приплотинной части скапливаются загрязнения, поступающие в результате естественного течения, ветрового нагона и циркуляционного потока ГРЭс. Хроническая токсичность обнаруживается в пробах воды, отобранных из района торфяного месторождения. Известно, что гуминовые вещества, поступающие при разложении торфа в воде, могут угнетать развитие синезеленых водорослей. Центральную, самую глубоководную часть водоема охладителя по данным биотестирования можно охарактеризовать как чистую. Токсичность воды водоема БГРЭС обусловлена как присутствием затопленных растительных материалов (торфа, затопленной древесной, кустарниковой растительностью), так и органическим вносом растительной биомассы, продуцируемой на мелководных участках акватории водоема [47]. 1.10 Изучение токсичности стоков Марийского целлюлозно-бумажного комбината на Daphnia magna
В ходе изучения токсичности стоков Марийского Целлюлозно-бумажного комбината на Daphnia magna 48 было отобрано 7 проб воды. Это 1-я-производственные стоки, 2-я - условно чистые стоки, 3-я - стоки, взятые из колодца пруда - отстойника, 4-я - проба, взятая после пруда-отстойника, 5-я - проба на выходе из водотока - залива о. Лопатинского, 6-я - проба, взятая из устья залива, 7-я - была отобрана на середине р. Волги выше по течению. Оценка токсичности проб проводилась по общепринятой методике оценки качества природных вод Лесникова [49]. В ходе опыта регистрировались следующие показатели: выживаемость и физиологическое состояние дафний.
Рис. 7. Диаграмма выживаемости дафний в опыте со сточной водой МЦБК и водой из водотока - залива о. Лопатинский.
По результатам биотестирования было выявлено, что сточная вода МЦБК обладает весьма сильной токсичностью действием по шкале Строганова, т.к. величина выживаемости дафний составило 0% за одни сутки, в то время как точные воды пруда-отстойника обладают слабой токсичностью, т.к. продолжительность жизни 50% дафний была более 10 суток. Вода, взятая после пруда-отстойника, обладает слабой токсичностью или отсутствием ее по шкале Строганова. Токсичность стоков МЦБК снижается после пруда-отстойника. Это может происходить за счет следующих факторов: 1. Снижение токсичности в результате процессов самоочищения пруда-отстойника. 2. Процессы самоочищения продолжаются в заливе о. Лопатинского, и при выходе в р. Волгу вода не отличается по токсичности от проб воды, взятой с середины р. Волги. Гальванические шламы в настоящее время используются мало, большие объемы данных отходов не нашли широкого применения и представляют большую опасность в плане загрязнения окружающей среды. С целью изучения влияния строительных композиций на объекты окружающей среды был применен метод биотестирования. Для определения токсичности были получены водные вытяжки. В тестируемых водных вытяжках определяли наличие или отсутствие острого токсикологического воздействия на дафний. Основным показателем токсичности неразбавленной водной вытяжки служила смертность рачков. Проба вытяжки оценивалась как обладающая острой токсичностью, если за 48 ч в ней погибло 50% и более дафний по сравнению с контрольной [50]. В эксперименте использовали вытяжки с pH = 6,5 - 7,5, имитирующие кислые атмосферные осадки. Водные вытяжки для образцов с добавкой шлама в количестве 0 - 4,5 мас. % острой токсичностью не обладают, так как гибель рачков менее 50 % [48]. Глава II. Экспериментальная часть
2.1 Подготовка исходных реагентов и растворителей
Ацетон - сушили над CaCl2, а затем кипятили над оксидом фосфора (Р2 О5) в течение двух часов и дважды перегоняли над Р2 О5, Ткип = 560С, n = 1.3550.
Этанол абсолютный. Этанол (ректификат) восемь часов кипятили над свежепрокаленным оксидом кальция (на 1 литр этанола 200г СаО), затем смесь 5г магниевых стружек, 0.5г сублимированного йода и 75 мл спирта, высушенного над СаО, кипятили с обратным холодильником до полного превращения Мg в этилат магния. В реакционную колбу добавляли остальное количество спирта, раннее обработанного СаО, кипятили смесь в течение 2х часов, и отгоняли спирт. Диэтиловый эфир сушили над щелочью и дважды перегоняли над металлическим натрием. Отогнанный эфир хранили над натрием, Ткип = 34-350С. Акриламид- CH2=CH-CONH2 использовали фирмы "Mitsubishi Chem. Ind. Ltd" (Япония) с Тпл = 84,5°С. Пропанол - сушили над CaО и перегоняли. Метанол марки «х.ч.», Ткип. = 64.5-65.00С. Гидроксид натрия, хлорид натрия, серная кислота марки «х.ч.» Гидрохлорид гуанидина (ГГХ) «х.ч». Инертный газ-аргон (о.с.ч). Во всех опытах использована бидистиллированная вода, рН 7. Очистка инициатора Персульфат аммония (ПСА) (NH4)2S2O8, µ-пероксо-бис (тетраоксосульфат) аммония, “ч.д.а.”, перекристаллизовывали из бидистиллированной воды несколько раз, затем высушивали в вакууме до постоянного веса.
2.2 Синтез мономерной соли на основе метакриловой и акриловой кислоты и гуанидина а) Получение этилата натрия. В трехгорлую колбу (объемом 2л) снабженную мешалкой и обратным холодильником, помещали необходимое количество абсолютированного этилового спирта (500 мл) и при непрерывном перемешивании понемногу добавляли металлический натрий (1 моль) в течение двух часов. После добавления всего натрия, реакционную массу перемешивали еще 1 час до полного растворения натрия. б) Получение гуанидина. В полученный раствор этилата натрия при перемешивании порциями добавляли эквимольное количество (1 моль) ГГХ. Реакционный раствор перемешивали в течение 4 часов и оставляли в холодильнике на ночь. На следующий день раствор гуанидина отфильтровывали от выпавшего осадка хлорида натрия. в) Получение метакрилата и акрилата гуанидина (МАГ, АГ). Полученный накануне реакционный раствор гуанидина помещали в колбу снабженную мешалкой, термометром, капельной воронкой. После охлаждения раствора гуанидина до - 10 - 6 0С при перемешивании прикапывали метакриловую или акриловую кислоту в течение двух часов. Скорость подачи регулировали так, чтобы температура в реакционной массе не превышала -5 - 0 0С. Для отвода избыточного тепла применяли охлаждающую баню из смеси ацетона и сухого льда. После прикапывания всего количества метакриловой или акриловой кислоты, рН реакционного раствора был близок к 7. Раствор перемешивали еще 4 часа при комнатной температуре, после чего колбу с продуктом реакции помещали в холодильник на несколько суток. Полученный прозрачный раствор мономерной соли в этаноле высаживали в 10 кратный избыток абсолютированного эфира. Выпавшие белые игольчатые кристаллы МАГ или АГ отфильтровывали через плотный стеклянный фильтр, многократно промывали абсолютным эфиром и сушили в вакууме при комнатной температуре. Выход МАГ 70-75%, выход АГ 80-85 %. Затем синтезированные соли подвергали двукратной перекристаллизации из смеси абсолютного спирта и ацетона 10:90. Структура и состав всех синтезированных мономерных солей были подтверждены совокупностью различных физико-химических методов анализа: ЯМР и ИК-спектроскопия, элементный анализ, Т.пл.. 2.3 Синтез сополимеров
Синтез полимеров и сополимеров производили по типичной методике радикальной полимеризации в ампулах. Предварительно приготовленные растворы мономеров и инициатора переносили в ампулу, которую вакуумировали трижды замораживая и дегазируя, после чего ампулы отпаивались и помещались в термостат для проведения гомо(со)полимеризации. 2.4 Биологические тест-объекты и показатели, используемые при установлении эколого-токсикологических нормативов Объекты и показатели, используемые при установлении эколого-токсикологических нормативов
2. 5 Методики биотестирования
Методика Н.С. Строганова [51] Основные положения: Острый опыт. Предлагаемый метод позволяет определить острую токсичность: а) сточных вод отдельных цехов предприятий, включая условно-чистые воды; б) сточных вод на разных этапах очистки; в) очищенных сточных вод при сбросе в водоем; г) химических веществ. Дафнии позволяют определить как качество природных вод, так и токсичность стоков. Показателем острой токсичности является гибель 50% и более дафний в анализируемой воде по сравнению с контролем в течение 24, 48 и 96 часов. Для определения качества природных вод ставятся хронические опыты по методике Л.А.Лесникова длительностью 10-15 суток. Методика Л.А. Лесникова [49] Отобранные пробы воды фильтруются через мельничный газ. Опыты можно ставить только после выравнивания температур в пробах и маточной культуре дафний. В каждую пробу с 0,3 л воды помещается по 10 дафний возрастом 6 суток. В течение опыта регулярно, (один раз в двое суток) под бинокуляром отмечается их состояние. Длительность опытов не менее 10суток. В пробы воды корм не добавляется. В ходе опыта воду не заменяют, молодь не удаляют. При просмотрах у дафний регистрируются: размеры (в делениях окулярмикрометра), состояние гонад и эмбрионов в выводковых камерах, их число, окраска тела, наличие и цвет капель жира, наполненность кишечника и его содержимого. У погибших и иммобилизованных дафний регистрируются симптомы гибели (тетаническое сокращение мышц туловища, судорожное опорожнение кишечника, побеление участков тела, яиц или эмбрионов и т.п.). Результаты опытов позволяют в основном качественно судить о характере изменения условий в водоеме. В качестве руководства в первом приближении можно использовать прикладываемую к методике определительную таблицу, составленную на основании анализа результатов опытов с разными веществами. Определительная таблица токсического действия веществ и физиологического состояния дафний. 1(2,3) Дафнии гибнут все в течение первых 4 суток. Острое летальное действие 4 2(1,3) Дафнии постепенно гибнут все или частично в сроки от 4 до 15 суток. Хроническое летальное действие 14 3(1,2) Дафнии не гибнут за срок до 15 дней или гибнут отдельные особи. Явной закономерности в сроках их гибели не обнаруживается 19 4(5,6,7) У иммобилизованных дафний исчезают капли жира, окраска тела снижается до 1 балла, наблюдаются (сохраняются) следы перистальтики кишечника, подергивание мышц плавательных антенн, иногда редкие сокращения сердца 8 5(4,6,7), Дафнии скапливаются у поверхности воды в сосуде, окраска тела становится 3м-5м (наблюдается помутнение), погибшие особи либо остаются у поверхностной пленки, либо падают на дно; отдельные мышцы погибших дафний вздрагивают у почти разложившихся особей, туловище у погибших дафний часто и выдвинуто далеко вниз через щель раковины. Гибель наступала от резкого дефицита кислорода (меньше 0,5 мг/л) 6(4,5,7) Наблюдается помутнение плазмы клеток сначала в жаберных отростках ног, затем всего туловища. 12 7(4,5,6) У дафний наблюдается судорожное сокращение мышц туловища, сопровождающееся выдавливанием части яиц или эмбрионов из выводковой камеры. Иногда при этом наблюдается судорожное опорожнение кишечника. Действие органических токсичных веществ с раздражающим типом действия: ряд циклических соединений, например фенолы, и другие, как формалин, нефтепродукты и т. п. 8(9) Дафнии сначала роятся в одном углу сосуда, кувыркаются, затем становятся вялыми и все чаще ложатся на дно. Фильтровальный аппарат их ничем не забит, кишечник либо пуст, либо имеет следы содержимого (баллы 1 и 2). Число яиц в выводковой камере сокращается вплоть до нуля. Развитие отложенных яиц протекает нормально. Дафнии голодают. Действие воды, взятой с олигосапробного участка водоема. 9(8) Фильтровальный аппарат дафний забит сгустками или слизью, животные ложатся на дно. При искусственном осторожном освобождении от такого засорения (препарировальной иглой) и перенесении в хорошие условия дафния может восстановить жизнедеятельность полностью и нормально размножаться. Часто сгустки или нити наблюдаются и на плавательных антеннах и на каудальной игле 10 10(11) Забит только фильтровальный аппарат. В среде содержаться взвеси в количествах делающих невозможным функционирование фильтровального аппарата дафний. 11(10) Забит только фильтровальный аппарат, слизистые комки или нити на плавательных антеннах и на каудальной игле. Вода для опыта взята с полисапробно - мезосапробного участка водоема. Внесено слишком много корма, особенно когда кормят дрожжами. 12(13) Помутнение плазмы наблюдаетя у иммобилизованных дафний. Действие хлоридов и сульфатов натрия и кальция и смесей этих солей.13(12) Помутнение плазмы жабр наблюдаетя у еще плавающих дафний,которые часто ложатся на дно, а затем судорожно всплывают и снова падают на дно. Часто у таких дафний уже прекращено дрожание глаза и сокращение сердца. Действие солей калия, магния аммония и тяжелых металлов.14(15,16,17,18) Дафнии постепенно бледнеют, у них исчезают капли жира, число яиц в выводковых камерах сокращается до 1-2, многие самки становятся бесплодными. Гибель наступает через 5-10 дней но отдельные особи живут и дольше. Дафнии скучиваются в одном углу сосуда и кувыркаются. Вода ля опыта взята с олигосапробного участка водоема. Внесено в опыт очень мало корма. 15(14,16,17,18) У дафний резко повышается балл окраски тела (4-5), которое часто становится несколько мутным, животные поднимаются к поверхности сосуда. Дефицит кислорода в среде порядка 1,5 мг/л. 16(14,15,17,18) У дафний в плавательных антеннах и каудальной игле бактериальные обрастания, балл окраски тела часто повышается; все яйца и эмбрионы в выводковых камерах погибают, часто разлагаются до превращения в сплошную пенистую массу. Вода для опыта взята из - мезосапробного участка водоема. Резкий перекорм дафний. 17(14,15,16,18) У части дафний через разные сроки от начала опыта наблюдается судорожное сокращение мышц туловища и выдавливание частияиц из выводковой камеры. Одни яйца развиваются неправильно, другие яйца гибнут и сбрасываются при линьке со шкуркой (эквузием).Действие хронических доз ряда циклических соединений типа фенолов,нефтепродуктов, инсектицидов и т. п. 18 (14,15,16,17) У дафний отмирает часть яиц в выводковой камере. Значительная часть выметанной молоди тут же погибает. Перед гибелью несколько снижается интенсивность окраски тела. Действие солей тяжелых металлов.19(20,21) Интенсивность размножения дафний понижается, среднее число яиц на самку 3-7. Дафнии бледнеют (1-2 балла), исчезают капли жира. Понижено наполнение кишечника 22 20(19,21) Окраска тела дафний умеренная (2-3 балла) Капли жира имеются. Наполнение кишечника 4-5 баллов. Средняя интенсивность размножения 18-40 яиц на самку 24 21(19,20) Окраска тела дафний яркая (4-5 баллов) 27 22(23) Случаев гибели яиц в выводковых камерах нет. Вода для опытов взята с олигосапробно-мезосапробного участка водоема. В опыты вносится не достаточно корма. 23(22) В выводковых камерах часть яиц гибнет(яйца иногда заметно увеличиваются в размерах) и часто в выводковых камерах одновременно присутствуют яйца и зародыши. Действие небольших концентраций солей тяжелых металлов. Иногда - это действие ухудшения условий среды и причины неясны. 24(25,26) В выводковых камерах все яйца развиваются нормально. Иногда на дафниях появляются эпибионты из водорослей (особенно в опытах с водой из природных водоемов, взятой в летнее время. Вода для опыта взята с - мезосапробного участка водоема. В опыт внесено оптимальное количество корма.25(24,26) У дафний в выводковых камерах часть яиц гибнет и прекращает развиваться, или часть их развивается без линек эмбрионов. После вымета нормально развитой молоди такие яйца сбрасываются на дно сосуда, часть их остается в выводковых камерах сброшенных шкурок. Действие небольших концентраций циклических соединений. В лабораторных опытах может быть следствием того, что дафниям в корм дается пожелтевшая культура водорослей. 26(24,25) У дафний отмирает часть яиц в выводковых камерах. На дафниях обрастания из бактерий, грибков и сувоек. Иногда резорбция яиц в гонадах. Вода для опыта взята с - мезосапробного участка водоема. Небольшой перекорм. 27(28) Обрастаний на дафниях нет, может даже быть довольно много капель жира. Функции размножения не нарушены. В среде пониженное содержание растворенного кислорода (2-3 мг/л).
2.6 Общая методика определения токсичности воды на дафниях
Для определения токсичности вод необходимо иметь культуру дафний. При культивировании дафний берут водопроводную воду, отстоянную не менее 7 суток и насыщенную кислородом (не менее 6,.0 мг/л), с pH =7,0 - 8,2; жесткость общая - 3-4 мг/л. Лучше всего использовать биологизированную воду из аквариума. Кормом служат зеленые водоросли (хлорелла) и хлебопекарные дрожжи. Дрожжи приготовляют так: берут 1 г. свежих или 0,3 г. воздушно-сухих дрожжей, заливают их 100мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают, дают отстояться в течение 30 минут. Используют только жидкость, которую добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Кормят дафний 1 - 2 раза в неделю. Зеленые водоросли Chlorella vulgaris можно приобрести в лаборториях и хранить в холодильнике (срок хранения 14 суток). Дозировка кормления для дафний: из расчета 2 мл/л суспензии водорослей хлореллы с плотностью 25-35млн кл/мл. Оптимальный режим для выращивания водорослей создается при соблюдении следующих условий: питательная среда Тамийя (таблица 4), круглосуточное освещение лампами дневного света и постоянное продувание атмосферным воздухом. Таблица №4 Состав питательной среды для культивирования зеленых водорослей.
Для культивирования дафний используют стеклянные сосуды емкостью 3 - 5 литров. Начальная плотность дафний от 6 до 10 особей на 1 л. Через 5 - 7 суток в сосуды добавляют воду для дальнейшего культивирования. В помещении, где находится культура дафний, не должно быть вредных газов и паров, оптимальная температура 20 градусов Цельсия, освещение рассеянное 12 - 14 часов в сутки. Обмен воды в культуре дафний проводят через 7суток. Отбор проб для анализа. Для анализа на токсичность берут воду объемом до 1 л. Время от начала забора до опыта не должно превышать 6 часов, а температура хранения 4 градуса Цельсия. Пробы промышленных сточных вод (2 - 3 л) отбирают из соответствующих коллекторов или открытых участков водотока, которые хранят в стеклянной таре в холодильнике. Проведение опытов. Опыты ставят в трех повторностях; в каждый стакан заливают по 200 мл раствора и сажают по 10 дафний. Их переносят стеклянной трубкой диаметром 5 - 7 мм. Каждая серия опытов сопровождается контрольными испытаниями с биологизированой водой. Длительность наблюдений 96-120 часов. Регистрируемые показатели. В кратковременных опытах основным показателем токсичности среды является выживаемость рачков, наблюдения за которой проводят непрерывно в течение первого часа воздействия раствора, через каждые 15 мин в продолжение второго часа, затем ежечасно до конца первого дня наблюдений, а в последующие сутки 2-3 раза в день. Время гибели рачков отмечают по наступлении неподвижности (иммобилизации): дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при легком прикосновении струей воды или покачивании стакана. Наблюдают за ходом эксперимента через 24, 48 или 96 часов. Дафний во время эксперимента не кормят. После окончания эксперимента производят подсчет дафний. Рассчитывают процент выживших особей. Проба воды оценивается как токсичная, если за 24 часа опыта в ней гибнет больше 50% дафний по сравнению с контролем. Для количественной оценки токсичности проб воды применялась четырехбальная система Н.С. Строганова. Таблица 5. Шкала токсичности по Н.С. Строганова [ ].
Для более детальной токсикологической оценки сточной и природной воды биотестирование должно вестись минимум на двух объектах параллельно. Один объект должен относиться к фитопланктону (хлорелла или сцередесмус), другой -- к зоопланктону (дафния магна или цериодафния). Предпочтительнее тестировать на хлорелле и цериодафнии, как на более чувствительных объектах. Пробы сточной воды для биотестирования отбирают, руководствуясь инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85[53]; отраслевыми стандартами или другими нормативными документами. Пробы природной воды отбирают, руководствуясь, ГОСТ 17.1.5.05-85[54]. Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 ч после их отбора. Если указанный срок не может быть соблюден, пробы хранят до двух недель с открытой крышкой внизу холодильника (при +4°С). Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов. Перед биотестированием пробы фильтруют через фильтровальную бумагу с размером пор 3,5--10 мкм. При определении наличия острого и хронического токсического действия воду тестируют без разбавления. Для учета результатов биотестирования при установлении величин ПДС и определения степени токсичности сточной и природной воды готовят серию разбавлении. Для контроля (вода без токсических веществ) и разбавлении используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессоров в течение семи суток. В тех случаях, когда результаты биотестирования учитывают при установлении величин ПДС, в качестве контрольной и разбавляющей служит природная вода, отобранная вне зоны влияния источника загрязнения и отфильтрованная через фильтровальную бумагу. Если отсутствует возможность отбора проб из контрольного створа, тестируют сточную воду на сбросе в водный объект в разбавлении, соответствующем таковому в контрольном створе. Кратковременное биотестирование -- до 96 ч -- позволяет определить острое токсическое действие воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50 и более процентов дафний за период времени до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем. Длительное биотестирование--20 и более суток -- позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости -- среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний. Культуру дафний выращивают в климатостате, люминостате, боксе или помещении, не содержащем токсических паров или газов. Оптимальная температура для культивирования дафний и биотестирования составляет 20±2°С, освещенность 400--600 лк при продолжительности светового дня 12--14 ч. Не допускают освещения дафний прямыми солнечными лучами. Стеклянную посуду для содержания дафний моют питьевой водой, хромовой смесью или соляной кислотой. Нельзя использовать для мытья синтетические моющие средства и органические растворители. В помещении, где находятся дафнии, не проводят обработку инсектицидами, не хранят летучие вещества и не работают с ними. Для культивирования дафний используют водопроводную воду, которую отстаивают и насыщают кислородом с помощью микрокомпрессоров не менее 7 сут. Используют также природную или аквариумную воду, отфильтрованную через бумажный фильтр. Вода для культивирования должна удовлетворять следующим требованиям: рН 7,0--8,2; жесткость общая 3--4 мг-экв/л, концентрация растворенного кислорода не менее 6,0 мг/л, солевой состав до 6 ‰. Оптимальная плотность культуры -- 25 половозрелых самок в 1 л воды. Раз в 7--10 сут. половину объема воды в сосуде с культурой дафний заменяют на свежую, удаляют сифоном скопившийся на дне осадок и при большой плотности культуры ее прореживают. Не рекомендуется аэрировать воду в сосудах с дафниями. Посев водорослей производят альгологически чистой культурой, которую выращивают в стерильных условиях. Культуру водорослей вносят в питательную среду в количестве, дающем светло-зеленое окрашивание. Исходная концентрация около 2 тыс. кл/мл. Культивируют водоросли в стеклянных кюветах, батарейных стаканах или плоскодонных колбах при круглосуточном освещении лампами дневного света 3000 лк и постоянном продувании культуры воздухом с помощью микрокомпрессоров. Через 7--10 суток, когда окраска культуры водорослей становится интенсивно зеленой, их отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 2--3 сут. Осадок разбавляют в два раза дистиллированной водой. Суспензию хранят в холодильнике не более 14 сут. Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 мл суспензии (600--1000 млн. кл/мл) на л воды. 1 -- 2 раза в неделю дафний кормят хлебопекарными дрожжами. Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,3 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды. После набухания дрожжи тщательно перемешивают. Образовавшуюся суспензию отстаивают в течение 30 мин. Недостающую жидкость добавляют в сосуды с дафниями в количестве 3 мл на 1 л воды. Раствор дрожжей хранится в холодильнике до двух суток. Можно кормить дафний сырым рисом. Рис предварительно размачивают в теплой воде (3--4 ч.) и вносят в культуру из расчета 1 -- 2 зерна на 1 л воды. Рис держат в культуре до 10 дней при постоянной продувке мелкодисперсными пузырьками воздуха. При хроническом опыте дафний кормят только хлореллой -- по 5 капель на 100 мл. При необходимости биотестирования воды с общим содержанием солей свыше 3 г/л выращивают культуру, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют дафний и минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. Вначале его вносят из расчета 500 мг/л. Через неделю минерализацию воды повышают еще на 250 мг/л. Эту операцию повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не выше 6 г/л с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно. Эта же среда служит контролем при биотестировании и в качестве разбавляющей. Адаптированных к повышенному содержанию солей дафний нельзя использовать для тестирования вод с более низким содержанием солей. При кратковременном биотестировании используют только односуточных дафний, а двухсуточных самок -- при длительном биотестировании. Перед началом биотестирования в пробе воды определяют концентрацию растворенного кислорода, которая должна быть не менее 6,0 мг/л (оптимально 6,0 --7,0). Если она ниже 6,0 мг/л, то перед биотестированием воду аэрируют с помощью микрокомпрессора. В процессе биотестирования аэрировать воду не рекомендуется. Биотестирование проводят при тех же условиях, что и культивировании. Результаты биотестирования считают правильными, если гибель дафний в контроле не превышает 10% в остром опыте и 25% в хроническом и концентрация растворенного в тестируемой воде кислорода в конце биотестирования составляет не менее 2 мг/л. Для определения наличия острого токсического действия сточной воды на сбросе в водный объект воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности сточной воды, отобранной из разных мест или в разное время, готовят серию разбавлении (не менее трех). Объем пробы воды для биотестирования без разбавления -- 500 мл, с учетом разбавлении -- 1 л. Посадку дафний в сосуды для биотестирования проводят следующим способом: стеклянной трубкой диаметром 0,5 -- 0,7 см отлавливают дафний из культуры, помещают в сачок из планктонного газа, погрузив его в тестируемую воду, переводят в нее дафний, посадку ведут от разбавлении тестируемой воды с большей кратностью к меньшей. В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд помещают по 10 односуточных дафний и экспонируют при оптимальных условиях в течение времени до 96 ч. При кратковременном биотестировании дафний не кормят. Учет выживших дафний проводят через 1, 6, 24, 48, 72, 96 ч. Особей считают выжившими, если они свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позднее 15 с после его легкого покачивания. Если в любой считываемый период времени в сточной воде гибнет 50 и более процентов дафний, биотестирование прекращают. Для определения наличия хронического токсического действия воды в контрольном и других створах водного объекта воду тестируют без разбавления. Если требуется сравнить степень токсичности разных проб воды или использовать результаты биотестирования при установлении величин ПДС, готовят серию разбавлении. Определяют минимальную кратность разбавления, при которой хроническое токсическое действие не проявляется. Объем пробы воды для биотестирования без разбавления -- 1 л, с учетом разбавлении -- 3 -- 5 л. В сосуды наливают по 300 мл контрольной и тестируемой воды или ее разбавлении. Повторность трехкратная. В каждый сосуд вносят одинаковое количество корма, помещают по 10 двухсуточных самок дафний и экспонируют при оптимальных условиях. Дафний кормят ежесуточно. Три раза в неделю в сосудах с дафниями производят смену контрольной и тестируемой воды на свежеотобранную. При смене воды дафний кормят за 3 ч до смены. Допускается использовать воду, хранящуюся в холодильнике. С момента появления молоди, в те сутки, когда меняют воду, производят учет выживших исходных самок и выметанной молоди. Для этого самок с помощью стеклянной трубки пересаживают в заранее подготовленные сосуды с контрольной и тестируемой водой (соответственно) и подсчитывают их количество в каждом сосуде. Оставшуюся воду процеживают через сито из планктонного газа. При этом на сите остается выметанная молодь, которую подсчитывают и удаляют. После того, как в контроле все исходные самки дадут по четыре помета, биотестирование заканчивают. Время биотестирования сокращается, если при промежуточном подсчете устанавливают достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний. При биотестировании сточной воды на сбросе в водный объект рассчитывают процент погибших дафний в тестируемой воде по сравнению с контролем А = (N2/N1) * 100% (1) N1 - среднее арифметическое количество дафний, выживших в контроле; N2 - среднее арифметическое количество дафний, выживших в тестируемой воде. Если А>50%, тестируемая вода оказывает острое токсическое действие, если А<50%, тестируемая вода не оказывает острого токсического действия на дафний. Для определения степени острого токсического действия тестируемой воды рассчитывают графическим методом: ЛКр50-96 ч -- кратность разбавления тестируемой воды, при которой гибнет 50% дафний за 96 ч; ЛКр0-96 ч -- минимальную кратность разбавления, при которой дафнии не гибнут за 96 ч. На оси абсцисс откладывают логарифмы величин кратности разбавлении тестируемой воды, а на оси ординат -- средние арифметические величины выживаемости дафний в процентах к контролю. Полученные точки соединяют прямой. От точек на оси ординат, соответствующих 50 и 100% выжив аемости, проводят линии, параллельные оси абсцисс. Из точек пересечения этих линий с экспериментальной прямой опускают перпендикуляры на ось абсцисс и находят логарифмы величин кратности разбавлении, которые будут соответствовать исковым величинам ЛКр50 и ЛКро. Чем больше величины ЛКр50 и ЛКро, тем токсичнее тестируемая вода. Степень токсичности можно также установить, рассчитав ЛКр50 -- среднее время гибели 50% дафний в тестируемой воде. Для этого строят график (на оси абсцисс откладывают время наблюдения, на оси ординат -- выживаемость в процентах к контролю). Чем меньше ЛКр50, тем токсичнее тестируемая вода. При биотестировании воды из контрольного или других створов водного объекта вывод о наличии хронического токсического действия делают на основании установления достоверности различия между показателем выживаемости или плодовитости дафний в контроле и в тестируемой воде. Для этого рассчитывают среднее арифметическое показателей выживаемости и плодовитости в контрольной и тестируемой воде Результаты биотестирования при разбавлении тестируемой воды с целью их использования при установлении величин ПДС или определения степени хронического токсического действия тестируемой воды обрабатывают с помощью вышеописанных приемов. Определяют минимальную кратность разбавления тестируемой воды, при которой различия между величинами показателей выживаемости и плодовитости дафний в контроле и соответствующем разбавлении будут недостоверными. Если получают две разные величины минимальной кратности разбавления тестируемой воды (одну, при которой недостоверным будет отличие от контроля показателя выживаемости, и другую, при которой недостоверным окажется отличие от контроля показателя плодовитости), вывод об отсутствии хронического токсического действия на дафний делают на основании большей величины. Периодически, не реже одного раза в месяц, необходимо проводить контроль чувствительности дафний и цериодафний к «эталонному» токсиканту бихромату калия (K2Cr2O7). Концентрация бихромата калия, которая в течение 24 часов иммобилизует 50% дафний, взятых для эксперимента, должна находиться в диапазоне 0,9--2,0 мг/л. Указанный диапазон концентраций вызывает 50%-ную иммобилизацию дафний и цериодафний. Испытания проводятся в соответствии с общими требованиями для биотестирования. Используется для испытания, бихромат признанного аналитического качества. Если результаты опытов не укладываются в указанный интервал, т» следует проверить правильность приготовления исследуемых растворов, соблюдение условий проведения опытов, правильность выбора возраста рачков. Если ошибки исключены, следует заменить культуру, получив ее в базовых лабораториях по биотестированию [55]. 2.7 Методика биотестирования синтезированных сополимеров на дафниях Daphnia magna Straus
Дафний в количестве 20 штук высаживали в чашки Петри, причем это были половозрелые особи, 4 - дневного возраста, способные к размножению без адаптации. Дафний не кормили, появившуюся молодь не отсаживали, а наблюдали за развитием ювенильных особей в модельных растворах. В ходе опыта с помощью бинокуляра регистрировались следующие признаки: двигательная активность, способность к размножению, фототаксис.
2.8 Методика биотестирования на хирономидах Chironomus dorsalis
Хирономид в количестве 10 штук высаживали в чашки Петри, это преимущественно личинки 2 и 3 стадии. В ходе хронического опыта гидробионтов кормили дрожжами, вводя в каждую чашку Петри по 1 мл суспензии. Регистрировались такие признаки как: двигательная активность, способность к превращению из личинки в куколку, а затем в имаго. Кроме того, в модельный раствор помещали кладку яиц взрослых особей и наблюдали за развитием личинок.
2.9 Методика биотестирования на комарах обыкновенных Culex sp
Личинок обыкновенных комаров, возраст которых составлял 2 дня, в количестве 10 штук высаживали в чашки Петри, затем приливали растворы сополимеров определенной концентрации. Визуально регистрировалась двигательная активность, поведение личинок у поверхности, способ питания, превращение личинок в имаго. После проведения биотестирования комаров высаживают из тестируемых растворов, помещают в контрольную пробу и продолжают наблюдение. 2.10 Методика биотестирования на водных жесткокрылых: Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp
Для биотестирования брали Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp. в количестве 5 штук и высаживали в модельные растворы. В ходе хронического опыта учитывали двигательную активность, фототаксис и способность к размножению, контроль проводили визуально, так как жесткокрылые имеют относительно большие размеры (55-80мм.) Далее см. методику 2.8. Глава III. Обсуждение результатов
Исключительная роль воды в жизни человека и всего живого на Земле обусловливает большое и постоянно возрастающее внимание к экологическому состоянию водных объектов. Особое внимание уделяется проблеме загрязнения воды, которая тесно связана с проблемой обеспеченности пресной водой. Следует отметить, что в настоящее время технология обработки воды как научно-техническое направление все еще значительно отстает от запросов практики. Поэтому при прогрессирующем загрязнении водоемов промышленными стоками и при увеличении числа примесей с различными свойствами проблема создания новых полифункциональных материалов для очистки воды становится особенно актуальной. Особое место среди флокулянтов занимают производные полиакриламида. Перспективными химическими структурами для получения новых производных полиакриламида являются гуанидинсодержащие соединения. В случае сополимеров акриламида с гуанидинсодержащими солями возможно совмещение полезных свойств, присущих индивидуальным мономерам. Как известно, гуанидинсодержащие соединения обладают биоцидными свойствами [56-58]. Известно также, что сочетание в полиакриламидных флокулянтах карбамидных групп с карбоксильными и аминогруппами препятствует свертыванию макромолекул в клубок и позволяет иметь развернутую оптимальную для флокуляции конформацию [59]. В связи с этим, представлялось важным изучение токсичности новых сополимеров акриламида с метакрилатом и акрилатом гуанидина, синтезированных по схемам 3, 4:
Схема 3. Получение сополимера акриламида с метакрилатом гуанидина Схема 4. Получение сополимера акриламида с акрилатом гуанидина
Методы биотестирования на ветвистоусых ракообразных занимают ведущее положение в системе экологического мониторинга природных вод, а биотест на дафниях Daphnia magna Strauss является наиболее стандартизованным из всех известных [20, 21, 60]. Как видно, из обзора литературы, при биотестировании природных вод на зоопланктоне регистрируют поведенческие реакции, патологические нарушения, метаболические (биохимические) показатели, физиологические функции, окраску тела, скорость выедания корма и др., но наиболее чувствительной и надежной считается тест-реакция, в которой регистрируется процессы размножения - выживаемость и плодовитость. Для определения токсичности ряда гомо - и сополимеров использовали методику определения токсичности воды с помощью дафний Daphnia magna Strauss, а также новых биоиндикаторов, раннее для этих целей неиспользованных - личинки комаров обыкновенных Culex sp. Дафний в количестве 20 штук высаживали в чашки Петри с исследуемыми образцами. Контроль проводили визуально и с применением бинокуляра, контролируя количество выживших дафний, причем учитывались изменения в движении и размножении рачков. Параллельно ставили контрольный опыт с природной водой. Наблюдения проводили 96 часов, дафний во время эксперимента не кормили. По окончании эксперимента проводили учет выживших дафний, выжившими считаются дафнии, если они свободно передвигаются или всплывают со дна. Коэффициент токсичности в %, рассчитывали по формуле:
Кt =100(Х1-Х2)/Х1 где, Х1 и Х2 среднее арифметическое количество выживших дафний в контроле и опыте. Проба воды оценивалась как обладающая острой токсичностью, если за 96 часов биотестирования в ней гибло 50% и более дафний по сравнению с контролем. Токсикологические характеристики сополимеров исследовали в зависимости от состава и концентрации при постоянной температуре. В качестве модельных соединений были взяты полиакрилатгуанидин (ПАГ), полиметакрилатгуанидин (ПМАГ), полиакриламид (ПАА). Экспериментальные результаты показали, что растворы гомополимеров и сополимеров без разбавления оказывают (рис.7) угнетающее действие на весь процесс размножения дафний, задерживает рост, наступление половой зрелости и появления первого помета, уменьшает количество пометов и плодовитость, повышает выброс молоди и яиц. При разведении в отношении 1:2 токсичность сополимеров снижается. Наименее токсичными являются растворы сополимеров с концентрацией от 0,1 до 0,01 %. Токсичность образцов зависит также от состава сополимеров, с увеличением содержания метакрилата гуанидина токсичность понижается.
32 Рис. 7. Зависимость коэффициента токсичности гомо - и сополимеров от состава и концентрации Анализ экспериментальных данных по исследованию токсичности сополимеров показывает, что растворы сополимеров МАГ:АА (20:80) и МАГ:АА (30:70) с концентрацией 0,1% и 0,01% практически не влияют на плодовитость дафний, но на 15% сокращают длительность жизни. Отметим, что гомополимер ПМАГ снижает плодовитость и длительность жизни у исследуемых дафний всего на 7%, а полиакриламид на 30 %. Выявлено, что токсичность полиакриламида выше, чем у сополимеров, т.е. даже небольшое содержание метакрилата гуанидина в сополимерах уже снижает токсичность полиакриламидного флокулянта. По сравнению с сополимерами акриламида с метакрилатом гуанидина, сополимеры с акрилатом гуанидина показали более низкую токсичность, причем токсичность тем выше, чем больше содержание в звеньях сополимеров АА (табл.6), диаграмма 1. Это ожидаемый результат для полиамфолитных сополимеров, учитывая то, что производные акриловых кислот имеют низкую токсичность, тогда как акриламид обладает высокой токсичностью. Отсюда можно сделать вывод о том, что при выборе сополимера в качестве флокулянта нужно учитывать состав сополимера. Учитывая полученные данные можно варьировать состав композиций для очистки воды для достижения максимального эффекта очистки при минимальных проявлениях токсичности. Таблица 6
Существование любого организма или сообщества организмов зависит от комплекса определенных условий или факторов среды обитания. Для использования в качестве биоиндикаторов подходят виды организмов, с низкой экологической валентностью, то есть способные выносить лишь ограниченные изменения условий существования и реагировать на любые изменения амплитуды колебаний экологических факторов. В этой связи совершенствование методов биологического тестирования путем выявления биоиндикаторов, активно реагирующих на изменение химического состава своей экологической ниши, безусловно, является важной задачей. Поэтому помимо D. magna, для токсикологической оценки водных растворов полимерных флокулянтов использовали также личинок комаров - звонцов Chironomus dorsalis, Platambus maculatus, Haliplus flavicollis и Gyrinus sp., Culex sp. Выбор в качестве объекта исследования именно этих видов обусловлено следующими причинами: - высокая численность популяции; - легко культивируются в лабораторных условиях; - продолжительность жизни выше по сравнению с дафниями. Результаты исследований на указанных биоиндикаторах показали, что наименее токсичными в исследованных условиях являются сополимеры АА с АГ по сравнению с ПАА, причем наименее токсичным образцом для данных тест-культур оказался сополимер АА: АГ (10:90), в растворе которого наблюдался переход личинок в куколки, а затем превращение в имаго. Использование новых биоиндикаторов также подтвердило меньшую токсичность сополимеров акриламида с акрилатом гуанидина (табл.8, 9, 10), диаграммы 2, 3 Таблица 8 Гибель тест-объектов (хирономиды) в тестируемой воде за 48 часов (хронический опыт)
Таблица 9 Гибель тест-объектов (жесткокрылые) в тестируемой воде за 48 часов (хронический опыт)
Таблица 10
Для выявления чувствительности дафний к тяжелым металлам, а также изучения способности полученных сополимеров и гомополимеров к комплексообразованию были приготовлены модельные растворы свинца разной концентрации и определена их токсичность для используемых биотестов. Выявлено, что исходная концентрация свинца 1г/л приводит к 99% летальному исходу для дафний. Минимальная концентрация свинца, при которой степень выживаемости дафний равна 82%, составляет 0,03 г/л. Концентрация свинца, равная 0,03 г/л совпадает с санитарно-токсикологической ПДК содержания свинца в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. Полученные результаты открывают возможность определять повышение ПДК свинца в воде методом биотестирования. В связи с этим, представляло интерес исследование комплексообразующих способностей гомополимеров и сополимеров по отношению к ионам свинца методом равновесного диализа. Экспериментальные исследования показали, что сополимеры не обладают комплексообразующей способностью по отношению к ионам свинца, так степень выживаемости дафний, в воде обработанной сополимерами составила всего 3%. Гомополимеры МАГ и АГ в отличие от сополимеров обладают комплексообразующей способностью к ионам тяжелых металлов. Степень выживаемости дафний составила 96 %, что свидетельствует о практически полном связывании ионов свинца данными гомополимерами. Результаты комплексообразующих способностей указанных полимеров подтверждены исследованиями модельных растворов методом атомно-адсорбционной спектроскопии. Таким образом, полученные результаты показали возможность регулирования токсичности сополимеров путем варьирования их состава и концентрации. Выводы
1) Впервые исследованы эколого-токсикологические характеристики новых флокулянтов - гуанидинсодержащих сополимеров акриламида методом биотестирования. 2) Показано, что токсичность сополимеров зависит от состава и концентрации, определены оптимальные условия их применения. Обнаружено, что токсичность сополимеров акриламида уменьшается с увеличением содержания гуанидинсодержащего мономера. 3) Выявлены новые биоиндикаторы для оценки токсичности сополимеров - личинки комаров обыкновенных, личинки поденок, жуки-вертячки, некоторые из которых оказались более чувствительными по сравнению с дафниями. 4) Разработаны методики оценки токсикологических свойств водных растворов полимеров с использованием выявленных биоиндикаторов. 5) Оценена чувствительность новых биоиндикаторов по отношению к ряду сополимеров и обнаружено, что наиболее чувствительным биоиндикатором являются личинки комара обыкновенного (Culex sp.). Литература
1. Шуберт Р. Основные принципы методов биоиндикации // Изучение загрязнения окружающей природной среды и его влияния на биосферу: Матер. 3 заседания Международной рабочей группы по проекту № 14 МАБ ЮНЕСКО. Л., 1986. С. 112-122. 2. Израэль Ю.А. Экология и контроль состояния природной среды. Л.: Гидрометеоиздат, 1984. 3. Филиппова Л.М., Инсаров Г.Э., Семевский Ф.Н. и др. О структуре и задачах экологического мониторинга // Проблемы экологического мониторинга и моделирование экосистем. Л., Гидрометеоиздат. 1978. Т. 1. С. 19-32. 4. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. Л., Гидрометеоиздат. 1989. Вып. 2. - 277с. 5. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод. Л., ЗИН. 1974. - 60 с. 6. Винберг Г.Г., Алимов А.Ф., Балушкина Е.В., и др. Опыт применения разных систем биологической индикации загрязнения вод // Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Л., Гидрометеоиздат. 1977. С. 124-131. 7. Брагинский Л.П. Некоторые принципы классификации пресноводных экосистем по уровням токсической загрязненности // Гидробиол. журн. 1985. Т. 21. № 6. С. 65-74. 8. Зенин А.А., Белоусова Н.В. Гидрохимический словарь. Л., 1988. - 235С. 9. Строганов Н.С., Исакова Е.Ф., Колосова Л.В. Метод биотестирования качества вод с использованием дафний // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. 1989. Вып. 1. - 78 с. 10. Лесников Л.А., Исакова Е. Ф., Колосова Л. В. Опыты на дафниях // Метод. Рекомендации по установлению ПДК загрязняющих веществ для воды рыбохозяйственных водоемов. М., 1986. 102 с. 11. Методическое руководство по биотестированию воды. РФ-118-02-90 / Под ред. А.Н. Крайнюковой. М., 1991. 87 с. 12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. - 348 с. 13. Исакова Е.Ф. Сезонные изменения фактической плодовитости Daphnia magna в лабораторной культуре // Гидробиол. Журнал. 1980. Т. 16. №4 14. Кокова В.Е. Непрерывное культивирование беспозвоночных. Новосибирск, 1982. - 231 с. 15. Гиляров А.М. Популяционная экология. М., 1990. - 467 с. 16. Пятаков М.Л. По поводу сезонного изменения плодовитости у ветвистоусых // Зоологический журнал. Т. 35. Вып. 12. 17. Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // Гидробиол. журн. - 2000. - Т. 36, № 5. - С.50-70. 18. Голубев А.А. и др. Количественная токсикология. - Л.: Медицина, 1973. - 286с. 19. Дятлов С.Е. Микробиотесты: новый подход в оценке токсичности водной среды // Наук. зап. Тернопільського держ. педагог. університету. - Сер: Біологія. - 4(15) Спец. віпуск: Гідроекологія. - 2001. - С.128-129. 20. Смирнов Н.Н. Биология ветвистоусых ракообразных / Зоология беспозвоночных - 3. - М., 1974. - 115 с. (Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР). 21. Метелев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикологния. - М.: Колос, 1971. - 246с. 22. Методическое руководство по биотестированию воды. РД-118-02-90. - М., 1991. - 49с. 23. Брагинский Л.П. Интегральная токсичность водной среды и ее оценка с помощью методов биотестирования // Гидробиол. журн. - 1978. - №1. - с.77-83. 24.Филенко О.Ф., Медянкина М.В. Роль донных грунтов в модификации токсичности загрязняющих веществ (на примере бихромата калия и сульфата имазолила) // Токсикологический вестник. - №4, - 2006, с. 7-11. 25.Медянкина М.В., Филенко О.Ф., Широков Д.А. Влияние донных осадков на токсичность тяжелых металлов для дафний. 1. Хром // Экологические приборы и системы. - №12, - 2006, с. 39-42. 26.Исакова Е.Ф., Медянкина М.В. Влияние донных отложений на токсичность хрома и меди в водной среде // Тезисы докладов Всероссийской конференции с участием стран ближнего зарубежья «Экология пресноводных экосистем и состояние здоровья населения», 25-28 апреля, г. Оренбург, с. 14-15. 27.Филенко О.Ф., Медянкина М.В. Роль состава донного грунта в модификации токсичности загрязняющих веществ (бихромата калия и сульфата имазалила) // Тезисы докладов Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии», 20-24 сентября 2005 года, п. Борок Ярославской обл., с. 151-152. 28. Кикнадзе Г.С., Есаков Б.П., Комаров В.М. Опыт оценки степени загрязнения водной среды по изменениям периода биения сердца дафнии. Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1983. 13 с. 29. Колпаев Б.И. // Методы биотестирования вод. Сб. статей. Черноголовка, 1988. - 103 с. 30. Гершензон Е.М., Тманов Б.Н., Левит Б.И. // Изв. Вузов. Радиофизика. 1980. Т. 23. №5. С. 534-541. 31. Усанов Д.А., Скрипаль А.В., Вагарин В.А. // ПТЭ. 1994. №6. С. 162-165. 32. Усанов Д.А., Скрипаль А.В., Вагарин В.А., Васильев М. Р. // Зарубежная радиоэлектроника. 1995. №6. С. 43-48. 33. Чечеткина Е.А. Выживаемость и поведенческая активность Daphnia magna как критерий оценки качества р. Протвы в районе г. Обнинска // Научная сессия МИФИ - 2005. С. 122 - 124. 34. Тушмалова. Н.А., Егорова Е.И. Использование поведенческих реакций гидробионтов в системе оценки качества окружающей среды. Учебное пособие. Обнинск: ИАТЭ, 2003. 35. Егорова Е.И., Белолипецкая В.И. Биотестирование и биоиндикация окружающей среды. Учебное пособие. Обнинск: ИАТЭ, 2000. 83с. 36. Оценка и регулирование качества окружающей природной среды. Учебное пособие для инженера-эколога // Под ред. А. Ф. Порядиа, А. Д. Хованского, изд-во дом «Прибой», 1996. 37. Павлечко В.Н., Курлович Т.А. Анализ степени опасности сбросов загрязняющих веществ в поверхностные воды // Сб. научн. обеспеч. республ. компл. программы охраны окруж. среды на 1991-1995гг. Сб. статей по РНТП 75.02 р.: «Охрана природы». - Мн., 1995. -С. 6-9. 38. Методическое руководство по биотестированию воды РД 11 8-02-90.- М., 1990, - 72 с. 39. Линник П.М. Формы нахождения тяжелых металлов в природных водах - составная часть эколого-токсикологической характеристики водных экосистем // Водные ресурсы. -1989. - №1. - С 123-135. 40. Тиво П.Ф.. Быцко И.Г. Тяжелые металлы и экология. - Мн.: ЮНИПОЛ, 1966. - 192 с. 41. Карюхина Г.А, Чурбанова И.Н. Контроль качества воды, М.,1977. - 245 с. 42. Патин С.А. Биотестирование как метод изучения и предотвращения загрязнения водоемов. Ленинград. 1987. - 179 с. 43. Брагинский Л.П., Величко И.М., Щербань Э.П. Пресноводный планктон в токсической среде. Киев. Изд. Наукова думка. 1987г. - 217 с. 44. Плохинский Н.А. Биометрия. Изд-во МГУ, 1970. - 506 с. 45. Фомина Е.С., Трошина Е.А. Биоиндикация и биотестирование как методы определения загрязненности водных объектов // Сборник статей V Международной научной конференции студентов и аспирантов «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов», 12-14 апреля 2006г., Донецк. 46. Морозова О.Г., Бабаева Н.Н., Морозов С.В., Репях С.М. Влияние затопленных растительных остатков на формирование гидрохимического режима водоема-охладителя Березовской ГРЭС -1. // Химия растительного сырья. 2001. №1. С. 89-92. 47. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод: Сб. Под ред. А.Н. Крайнюковой. Черноголовка, 1998. С. 4-14. 48. Самойлов К., Вальтер Е. О загрязненности и роли залива на о. Лопатинском в обезвреживании промышленных сточных вод. // «Экообраз» - 1996. №2. 49. Лесников Л.А. Методика оценки влияния воды из природных водоёмов на дафний. В кн.: “Методики биологических исследований по водной токсикологии. Изд-во “Наука”.1971. - 228 с. 50. Мариева Т. Биотестирование сточных вод МЦБК, СШ-1, г. Волжск 51. Строганов Н.С. Методика определения токсичности водной среды. Ленинград.1987. - 215 с. 52. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. М.: 1991. 53. Инструкцией по отбору проб для анализа сточных вод НВН 33-5.3.01-85(14) - с. 46. 54. ГОСТ 17.1.5.05-85(15). 55. http://yellow.mifors.com/yellow/info/560.html 56.Химическая энциклопедия / под ред. И.Л.Кнунянца. 1988, M., Т. 1 с. 617. 57. М.Д. Машковский, Лекарственные средства, Торсинг, Харьков, 1997, т.1, 544с., т.2, 591с. 58. П.А. Гембицкий, И.И. Воинцева.Полимерный биоцидный препарат полигексаметиленгуанидин. Полиграф, Запорожье, 1998, 42 с. 59. Вейцер Ю.И., Минц Д.М. Высокомолекулярные флокулянты в процессах очистки природных и сточных вод.- М.: Стройиздат, 1984.-200 с. 60. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. - М.: Химия, 1986, c.296. |
| ! | Как писать дипломную работу Инструкция и советы по написанию качественной дипломной работы. |
| ! | Структура дипломной работы Сколько глав должно быть в работе, что должен содержать каждый из разделов. |
| ! | Оформление дипломных работ Требования к оформлению дипломных работ по ГОСТ. Основные методические указания. |
| ! | Источники для написания Что можно использовать в качестве источника для дипломной работы, а от чего лучше отказаться. |
| ! | Скачивание бесплатных работ Подводные камни и проблемы возникающие при сдаче бесплатно скачанной и не переработанной работы. |
| ! | Особенности дипломных проектов Чем отличается дипломный проект от дипломной работы. Описание особенностей. |
| → | по экономике Для студентов экономических специальностей. |
| → | по праву Для студентов юридических специальностей. |
| → | по педагогике Для студентов педагогических специальностей. |
| → | по психологии Для студентов специальностей связанных с психологией. |
| → | технических дипломов Для студентов технических специальностей. |
| → | выпускная работа бакалавра Требование к выпускной работе бакалавра. Как правило сдается на 4 курсе института. |
| → | магистерская диссертация Требования к магистерским диссертациям. Как правило сдается на 5,6 курсе обучения. |
| Дипломная работа | Формирование устных вычислительных навыков пятиклассников при изучении темы "Десятичные дроби" |
| Дипломная работа | Технологии работы социального педагога с многодетной семьей |
| Дипломная работа | Человеко-машинный интерфейс, разработка эргономичного интерфейса |
| Дипломная работа | Организация туристско-экскурсионной деятельности на т/к "Русский стиль" Солонешенского района Алтайского края |
| Дипломная работа | Разработка мероприятий по повышению эффективности коммерческой деятельности предприятия |
| Дипломная работа | Совершенствование системы аттестации персонала предприятия на примере офиса продаж ОАО "МТС" |
| Дипломная работа | Разработка системы менеджмента качества на предприятии |
| Дипломная работа | Организация учета и контроля на предприятиях жилищно-коммунального хозяйства |
| Дипломная работа | ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ ФИНАНСОВОГО СОСТОЯНИЯ ООО «АКТ «ФАРТОВ» |
| Дипломная работа | Психическая коммуникация |